Меченый микромасштабный термофорез эффективно получает константы диссоциации, или KD, различных биохимических взаимодействий. Этот протокол и сопровождаемое видео дают приблизительное сродство К Vam7, единственному растворимому белку SNARE в дрожжах, к фосфатидной кислоте. Это способ, которым Vam7 связывается с двумя мембранами перед взаимодействием с другими белками.
Этот метод быстро получает KD для различных биохимических взаимодействий при низких затратах, с высокой воспроизводимостью и с минимальными затратами на белок. Этот метод подходит для первой стадии фармацевтической разработки, что позволяет легко получить KD для определения потенциальных соединений свинца. Перед началом анализа включите выключатель питания на задней панели устройства MST и откройте управляющее программное обеспечение.
Убедитесь, что компьютер подключен к устройству и находится в состоянии подключения, и установите для параметра MST Before значение 3 секунды, для MST — значение 30 секунд, а для параметра Восстановление флуоресценции — значение через 1 секунду. Для каждой капиллярной трубки введите название целевого лиганда, название анализируемого лиганда, концентрацию мишени и самую высокую концентрацию титрования с использованием коэффициента титрования автозаполнения. Выберите диапазон степеней MST и введите значения для каждого питания, чтобы проверить наиболее надежную посадку привязки.
Чтобы подготовить меченые образцы MST, разбавьте раствор Vam7-октагистидина до концентрации 200 наномоляров и краситель NTA-Atto 647 до 100 наномолярной концентрации, оба в PBS. Смешайте Vam7-октагистидин и краситель NTA-Atto 647 в объемном соотношении 1:1 и дайте смеси постоять при комнатной температуре, защищенной от света, в течение 30 минут. В конце инкубации центрифугируют смесь красителя и белка и хранят раствор при 4 градусах Цельсия в течение нескольких часов перед использованием.
Затем подготовьте образец, возьмите окрашенный лиганд и подвергните анализируемому веществу. Для микромасштабного термофореза образца откройте устройство и выдвиньте капиллярную стойку наружу. Загрузите капилляры образца в стойку с наибольшей концентрацией в первом положении и выберите красный канал в управляющем программном обеспечении.
Затем загрузите стойку в инструмент. Затем выберите диапазон мощности MST и запустите измерение Cap Scan MST и оцените реакцию сдвига. Здесь показаны термофоретические следы одного испытания титрования DiC8 PA 1:1, начиная с 500 микромолей против 50 наномоляров NTA-Atto 647, меченых доменом Vam7.
Можно наблюдать начальную флуоресценцию, скачок во времени и термофорез, что позволяет рассчитать KD из любого одного или комбинации этих измерений. Кривая насыщения может быть построена на основе этих результатов, например, для термофореза с выходом временного скачка, как показано на графике. Как правило, результаты MST определяются с использованием логарифмической шкалы, принимая во внимание концентрацию белка для определения сродства связывания путем выбора модели KD и ввода концентрации белка.
При выполнении этого протокола убедитесь, что раствор находится в центре капилляра и что нет пузырьков воздуха и что капилляр не имеет пыли или раствора на внешней стороне капилляра. Изотермическая титрующая калориметрия или поверхностный плазмонный резонанс могут быть использованы для проверки полученного экспериментального KD. Если существует потенциальная совместная привязка, то следующим логическим методом, используемым с учетом ресурсов, будет МТЦ.
Этот метод позволил традиционным исследователям биологии включить методы биофизического скрининга в свои исследования для определения взаимосвязей путей. Одним из примеров этого метода является клеточная лизаза с целевым белком, экспрессируемым эндогенно, где метка GFP является новым способом выполнения традиционного анализа.
