والهدف العام لهذه الإجراءات هو فحص مثبطات تكرار فيروس زيكا في شكل فحص عالي الإنتاجية، باستخدام مقايسات قائمة على الرد و/أو على أساس الإنزيم الفيروسي. يتطلب اكتشاف الأدوية المضادة للفيروسات تطوير فحوصات خلوية وبيوكية كيميائية موثوقة يمكن إجراؤها في أشكال فحص عالية الإنتاجية. إن الفحوص القائمة على الردكون والمقايسات الفيروسية القائمة على الإنزيم هي استراتيجيتان قيمتان لاختبار مركبات الجزيئات الصغيرة كمثبطات لفيروس زيكا.
Replicons هي أنظمة شبه جينية ذاتية التكرار يتم التعبير عنها في خلايا الثدييات حيث يتم استبدال الجينات الهيكلية الفيروسية بجين مراسل. في مختبرنا، طورنا نظام رد فيروس زيكا، بما في ذلك رينيلا لوسيفيراز، الذي يتم التعبير عنه بشكل ثابت في خطوط خلايا الهامستر BHK-21. الآثار المثبطة للمركبات على تكرار الحمض النووي الريبي الفيروسي يمكن تقييمها بسهولة عن طريق قياس الانخفاض في نشاط لوسيفيراز.
لتوصيف الأهداف المحددة للمركبات المحددة ، أنشأنا في المختبر المقايسات القائمة على الفلورسينس لإعادة دمجها NS3 protease وNS5 RNA تعتمد على البوليميراز ، وRdRp. ابدأ بزراعة خلايا زيكا الفيروسية حتى تصل إلى التقاء 70 إلى 90 في المئة. في تدفق صفح معقم، قم بإزالة الوسائط والتخلص منها من القارورة.
إضافة خمسة ميل من تريبسين-EDTA إلى القارورة. نشر محلول التربسين على الخلايا وترك القارورة لمدة خمس إلى 10 دقائق للخلايا لفصل. حصاد الخلايا التي أعيد إنفاقها ووضعها في أنبوب 50 ميل معقمة والطرد المركزي لمدة 125G خلال خمس دقائق.
بعد التخلص من supernatant، resuspend الخلايا في خمسة مل من DMEM 10٪ FBS للعد. ضبط الخلايا إلى مرتين 10 إلى 4 لكل بئر والبذور لهم في لوحة 96 جيدا. ثم احتضان لوحة لمدة 16 ساعة في 37 درجة مئوية في حاضنة مرطب ثاني أكسيد الكربون.
بعد ذلك تجاهل المتوسط وإضافة 100 ميكرولتر لكل بئر من DMEM 2٪ FBS. إضافة ميكرولتر واحد من المركب لكل بئر ليؤدي إلى تركيز نهائي من 10 ميكرومولار و 1٪ DMSO في وسيط المقايسة. في العمود الأول والأخير، قم بإعداد عنصر التحكم الإيجابي والسلبي.
احتضان اللوحة لمدة 48 ساعة عند 37 درجة مئوية في حاضنة مرطب ثاني أكسيد الكربون. إعداد رينيلا لوسيفيراز تحلل العازلة في كاشف وفقا لتعليمات التصنيع. بعد التخلص من supernatant من الخلايا إضافة 25 ميكرولتر من رينيلا لوسيفيراز lyse العازلة لكل بئر.
إضافة 100 ميكرولتر من رينيلا لوسيفيراز كاشف لكل بئر إلى لوحة بيضاء مبهمة 96 جيدا. نقل 20 ميكرولتر من lysate الخلية إلى لوحة بيضاء ومن ثم قراءة إشارات التلألؤ في لومينوميتر. بالنسبة لمقايسة MTT ، أظهر الإجراء سابقا وبعد احتضان المركب إضافة 10 ميكرولتر لكل بئر من محلول MTT إلى الخلايا واحتضان اللوحة عند 37 درجة مئوية في مرطب ثاني أكسيد الكربون لمدة 24 ساعة.
تجاهل supernatant وإضافة 100 ميكرولتر من DMSO إلى كل بئر، ومن ثم تليين بلورات formazan عن طريق الأنابيب صعودا وهبوطا. قراءة ماصة في 570 نانومتر في مطياف. بعد ذوبان المواد على الجليد، وإعداد كمية مناسبة من تخفيف البروتين للوصول إلى تركيز النهائي من أربعة نانومولار لكل بئر.
في لوحة بيضاء 96 جيدا، والاستغناء عن 84 ميكرولتر من المخزن المؤقت المقايسة في كل بئر. لإعداد رد فعل التحكم، أضف ميكرولتر واحد من DMSO إلى العمود الأول من اللوحة. إضافة ميكرولتر واحد من المركبات المختبرة للوصول إلى تركيز نهائي من 10 ميكرومولار إلى لوحة.
الاستغناء عن خمسة ميكرولتر لكل بئر من محلول البروتيز، باستثناء الضوابط واحتضان لوحة في أربع مئوية لمدة 30 دقيقة. لبدء رد الفعل، والاستغناء عن 10 ميكرولتر من محلول الأسهم الركيزة الفلورية إلى الآبار. اتبع رد فعلهم باستخدام مقياس الفلور المحدد في المعلمات المناسبة.
لهذه الدورة، يجب إعداد جميع الكواشف مع المياه المعالجة DEPC. أنال الحمض النووي الريبي البولي يوريدين عن طريق احتضانه في 55 درجة مئوية لمدة خمس دقائق في دورة الحرارية. إذابة المواد على الجليد وتمييع البروتين للوصول إلى تركيز نهائي من 250 نانومولار في المخزن المؤقت للآساءة.
إعداد SYBR الأخضر الأول حل المقايسة العازلة، ومن ثم إضافة ATP والجيش الملكي النيبالي anealed إلى تركيز نهائي من ميليمولار واحد و 300 نانومولار، على التوالي. في لوحة PCR، أضف 24.5 ميكرولتر من البروتين المخفف في الأعمدة من 1 إلى 11. إضافة نفس وحدة التخزين من المخزن المؤقت المقايسة في الآبار المتبقية.
إضافة 0.5 ميكرولتر لكل بئر من المركبات والضوابط للوصول إلى تركيز النهائي من 10 ميكرومولار. بعد 15 دقيقة حضانة، بدء رد الفعل بإضافة 25 ميكرولتر من محلول الركيزة وختم لوحة. اتبع رد الفعل في نظام PCR في الوقت الحقيقي المحتضنة في 30 مئوية باستخدام فلتر FAM.
في الشكل 1A، نرى تمثيلا تخطيطيا لبناء الحمض النووي الريبي وضعت للحصول على خطوط خلايا زيكا replicon الفيروسية، مما يدل على أن الجين Rluc استبدال التسلسلات الهيكلية وكاسيت IRES جديدة إدراجها في 3'end. ويشمل أيضا المروج T7 في تسلسل فيروس دلتا التهاب الكبد ribozyme للنسخ في المختبر وتوليد 3'end أصيلة ونسخة الجيش الملكي النيبالي، على التوالي. في الشكل 1B، نرى تمثيلا تخطيطيا لمقايسة الخلية المستندة إلى replicon.
في الشكل 1C، نرى منحنيات الجرعة والاستجابة ومنحنيات السمية الخلوية لمجمع معين تم الحصول عليها باستخدام نظام الرد Rluc. في الشكل 2A، نرى تمثيل تخطيطي للمقايسة المستخدمة لتحديد نشاط protease NS2B-NS3. في الشكل 2B، نرى منحنى الجرعة استجابة مثبط معين يستهدف protease NS2B-NS3.
في الشكل 2C، نرى تمثيل تخطيطي لمقايسة الاستطالة المستخدمة لتحديد نشاط NS5 RdRp. في الشكل 2D، نرى مجموعة الاستجابة للجرعة من مثبط معين يستهدف نشاط فيروس زيكا RdRp. ويمكن تكييف الإجراءات الواضحة بسهولة للفحص في شكل 384 أو 1، 536 بئرا.
بالنسبة للفحوصات عالية الإنتاجية المستندة إلى replicon ، قمنا بتطوير خط خلايا مستقر يضم فيروس زيكا متماثلا يحتوي على تسلسل رينيلا لوسيفيراز في النهاية 5 ، وكذلك جين فوسفوسفوترانس النيوميسين مدفوعا بموقع دخول ريبوسومي داخلي في النهاية الثالثة. بسبب عدم وجود الجينات الهيكلية، replicons لا تنتج virions ذرية. وبالتالي، القضاء على خطر العدوى الفيروسية المكتسبة في المختبر.
بالإضافة إلى ذلك ، أظهرنا أيضا الإجراءات المستخدمة في المقايسات الفيروسية القائمة على الإنزيم لبروتيز NS3 المؤتلف وNS5 RdRp. تم قياس النشاط البروتيوليكي للبروتيز الفيروسي باستخدام ركيزة الببتيد الفلورية ، التي تحتوي على التعرف على البروتيز فيروس زيكا وتسلسل الانقسام إلى جانب مخزون الفلورسينس أمينوميثيلكومارين. فيما يتعلق ببوليميراز الحمض النووي الريبي المعتمد على NS5 ، يتم اكتشاف نشاط الاستطالة مباشرة من خلال زيادة الإشارة الفلورية لتنفيذ SYBR Green I.These ، والقياس المباشر ، والقدرة على تحمل التكاليف هي نقاط رئيسية لأساليب المستخدم القائمة على الفلورسينس كمنصات فحص عالية الإنتاجية.
