これらの手順の全体的な目標は、応答コンベースおよび/またはウイルス酵素ベースのアッセイを使用して、ハイスループットスクリーニング形式でジカウイルス複製の阻害剤をスクリーニングすることです。抗ウイルス薬の発見は、高スループットスクリーニング形式で行うことができる信頼性の高い細胞および生化学的アッセイの開発を必要とします。Repliconベースのスクリーニングとウイルス酵素ベースのアッセイは、ジカウイルスの阻害剤として低分子化合物を試験するための2つの貴重な戦略です。
Repliconsは、ウイルス構造遺伝子がレポーター遺伝子に置き換えられる哺乳類細胞で発現する自己複製サブゲノム系である。私たちの研究室では、赤ちゃんハムスターBHK-21細胞株で安定して発現するレニラルシファーゼを含むジカウイルスレミコンシステムを開発しました。ウイルスRNA複製に対する化合物の阻害効果は、ルシファーゼ活性の低下を測定することによって容易に評価することができる。
同定された化合物の特異的標的を特徴付けるために、我々は組み換え発現NS3プロテアーゼおよびNS5 RNA依存性RNAポリメラーゼに対するインビトロ蛍光ベースのアッセイを確立し、70〜90%の合流に達するまでジカウイルスレコン細胞を培養して開始する。滅菌層流で、フラスコから培地を取り出して捨てます。
フラスコにトリプシン-EDTAの5ミルを追加します。トリプシン溶液を細胞の上に広げ、フラスコを5~10分間放置して細胞を取り外します。再懸濁した細胞を収穫し、5分間に無菌50ミルチューブに入れ、遠心分離機で125Gにします。
上清を捨て、カウントするためにDMEM 10%FBSの5ミルで細胞を再懸濁する。細胞をウェルあたり10〜4回に調整し、96ウェルプレートに播種します。その後、CO2加湿器インキュベーターで37°Cで16時間プレートをインキュベートします。
次に、培地を廃棄し、DMEM 2%FBSのウェルあたり100マイクロリットルを追加します。化合物をウェルあたり1マイクロリットル添加して、アッセイ媒体中に10マイクロモルおよび1%DMSOの最終濃度を得る。最初の列と最後の列で、正と負のコントロールを準備します。
CO2加湿器インキュベーターで37°Cでプレートを48時間インキュベートします。製造指示に従って試薬でレニラルシファーゼリシスバッファーを準備します。細胞から上清を捨て、後に、レニラルシファーゼのライゼバッファーをウェルあたり25マイクロリットル添加する。
1ウェルあたり100マイクロリットルのレニラルシファーゼアッセイ試薬を白色の不透明な96ウェルプレートに加えます。細胞ライセートの20マイクロリットルを白いプレートに移し、ルミノメーターで発光信号を読み取ります。MTTアッセイの場合、手順は以前に実証されており、化合物インキュベーション後、MTT溶液のウェルあたり10マイクロリットルを細胞に加え、CO2加湿器でプレートを24時間CO2加湿器で37°Cでインキュベートします。
上清を捨て、各ウェルに100マイクロリットルのDMSOを加え、上下にピペットを作ってフォルマザン結晶を可溶化します。分光光度計で570ナノメートルの吸収剤を読み取ります。氷上の材料を解凍した後、適切な量のタンパク質希釈を調製し、井戸あたり4ナノモルの最終濃度に達する。
96ウェルの白いプレートで、各ウェルに84マイクロリットルのアッセイバッファーを分配する。制御反応を調製するには、プレートの最初のカラムにDMSOの1マイクロリットルを加えます。試験した化合物を1マイクロリットル加え、プレートに10マイクロモルの最終濃度に達する。
プロテアーゼ溶液のウェルあたり5マイクロリットルを分配し、コントロールを除き、プレートを4°Cで30分間インキュベートします。反応を開始するには、10マイクロリットルのフッ素基質ストック溶液をウェルに分配する。適切なパラメータで設定された蛍光計を使用して、その反応に従ってください。
このセッションでは、すべての試薬をDEPC処理水で調製する必要があります。ポリウリジンRNAをサーマルサイクラーで55°Cで5分間インキュベートしてアニールする。氷上の材料を解凍し、タンパク質を希釈してアッセイバッファー内の250ナノモルの最終濃度に達します。
SYBRグリーンI溶液アッセイバッファーを調製し、ATPとアニールRNAをそれぞれ1ミリモルと300ナノモルの最終濃度に加えます。PCR プレートに、24.5 マイクロリットルの希釈したタンパク質を列 1 ~ 11 に加えます。残りのウェルに同じ量のアッセイバッファーを追加します。
化合物およびコントロールのウェルあたり0.5マイクロリットルを加えて、10マイクロモルの最終濃度に達します。15分間のインキュベーションの後、25マイクロリットルの基質溶液を加えて、プレートをシールして反応を開始する。FAMフィルターを使用して30°CでインキュベートされたリアルタイムPCRシステムでの反応に従ってください。
図1Aでは、ジカウイルスリレコン細胞株を得るために開発されたRNA構築物の模式的表現を見て、3'末端に挿入された構造配列およびIRES新しいカセットをRluc遺伝子が置き換えることを示している。また、インビトロ転写用および本物の3'末端およびRNA転写物の生成のための肝炎デルタウイルスリボザイム配列におけるT7プロモーターも含まれる。図1Bでは、レプレコンベースの細胞アッセイの概略表現を見る。
図1Cでは、Rluc repliconシステムを用いて得られた所定の化合物の用量応答曲線および細胞毒性曲線を見る。図2Aでは、NS2B-NS3プロテアーゼの活性を決定するために使用されるアッセイの概略表現を見る。図2Bでは、NS2B-NS3プロテアーゼを標的とする所定の阻害剤の用量応答曲線を示す。
図2Cでは、NS5 RdRp活性を決定するために使用される伸びのアッセイの概略図を見る。図2Dでは、ジカウイルスRdRp活性を標的とする所定の阻害剤の用量反応群が見られた。実証された手順は、384または1、536ウェル形式でスクリーニングに容易に適応することができる。
レプリコンベースのハイスループットスクリーニングでは、5'末端にレニラルシファーゼ配列を含む複製ジカウイルスレプリコンと、3'末端の内部リボソームエントリサイトによって駆動されるネオマイシンホスホトランスセラーゼ遺伝子を含む安定した細胞株を開発しました。構造遺伝子の欠如のために、レプコンは子孫のビリオンを産生しない。したがって、実験室でウイルス感染を獲得するリスクを排除する。
また、組換えNS3プロテアーゼおよびNS5 RdRpに対するウイルス酵素ベースのアッセイに用いる手順についても実証した。ウイルスプロテアーゼのタンパク質分解活性を、蛍光株ストックアミノメチルクマリンと結合したジカウイルスプロテアーゼ認識および切断配列を含むフッ素化ペプチド基質を用いて測定した。NS5 RNA依存性RNAポリメラーゼに関しては、その伸び活性はSYBR Green Iの蛍光シグナルの増加によって直接検出されます。
