이러한 절차의 전반적인 목표는 보충 기반 및/또는 바이러스 효소 기반 의 검정을 사용하여 고처리량 스크리닝 형식으로 Zika 바이러스 복제 억제제를 선별하는 것입니다. 항바이러스 약물 발견은 고처리량 스크리닝 형식으로 수행될 수 있는 신뢰할 수 있는 세포 및 생화학적 분석을 개발해야 합니다. Replicon 기반 스크리닝 및 바이러스 효소 기반 실험은 Zika 바이러스의 억제제로서 작은 분자 화합물을 테스트하는 두 가지 중요한 전략입니다.
레플리턴은 바이러스 구조 유전자가 리포터 유전자로 대체되는 포유류 세포에서 발현된 자가 복제 형체 시스템입니다. 우리의 실험실에서, 우리는 아기 햄스터 BHK-21 세포주에서 안정적으로 표현되는 Renilla luciferase를 포함하여 Zika 바이러스 보충 시스템을 개발했습니다. 바이러스 RNA 복제에 대한 화합물의 억제 효과는 루시파아제 활성의 감소를 측정하여 쉽게 평가할 수 있다.
확인된 화합물의 특정 표적을 특성화하기 위해, 우리는 재조합 발현 된 NS3 프로테아제 및 NS5 RNA 의존 RNA 폴리머라제에 대한 체외 형광 기반 의 애서를 설립, RdRp. 그들은 70 ~ 90 %의 합류에 도달 할 때까지 Zika 바이러스 성 레플리콘 세포를 배양하여 시작. 멸균 라미나르 흐름에서 플라스크에서 미디어를 제거하고 폐기합니다.
플라스크에 트립신-EDTA 5마일을 추가합니다. 트립신 용액을 세포 에 퍼뜨리고 플라스크를 5-10분 동안 방치하여 세포가 분리됩니다. 재중단 된 세포를 수확하고 멸균 50 밀 튜브에 놓고 5 분 동안 125G동안 원심분리기를 놓습니다.
상체를 폐기한 후, 계산을 위해 DMEM 10%FBS의 5개 mils에서 세포를 다시 분리합니다. 세포를 우물당 10-4로 2회 조정하고 96웰 플레이트에 시드합니다. 그런 다음 CO2 가습기 인큐베이터에서 섭씨 37°C에서 16시간 동안 플레이트를 배양합니다.
다음으로 매체를 폐기하고 DMEM 2% FBS의 웰당 100 마이크로리터를 추가합니다. 10 마이크로몰라와 분석 매체에서 1%DMSO의 최종 농도를 초래하기 위해 우물당 화합물의 마이크로리터 1개를 첨가한다. 첫 번째 열과 마지막 열에서 양수 및 음수 제어를 준비합니다.
CO2 가습기 인큐베이터에서 섭씨 37°C에서 48시간 동안 플레이트를 배양합니다. 제조 지침에 따라 리닐라 루시파라제 리시 버퍼를 시약으로 준비하십시오. 세포에서 상체를 폐기한 후 렌닐라 루시포라제 리세 버퍼25마이크로리터를 첨가한다.
레닐라 루시파라제 분석 분석 시약 100마이크로리터를 흰색 불투명 한 96웰 플레이트에 잘 넣습니다. 셀 용액 20 마이크로리터를 흰색 플레이트로 옮은 다음 발광계에서 발광 신호를 읽습니다. MTT 분석의 경우, 절차는 이전에 입증하고 화합물 인큐베이션 후 MTT 용액의 우물 당 10 마이크로 리터를 세포에 추가하고 24 시간 동안 CO2 가습기에서 37 섭씨에서 플레이트를 배양했다.
상체를 버리고 각각의 우물에 100 마이크로리터를 추가한 다음 위아래로 피펫을 하여 포르마잔 결정을 용해시합니다. 분광계에서 570 나노미터에서 흡수제읽기. 얼음에 물질을 해동 한 후, 잘 당 4 나노 몰라의 최종 농도에 도달하기 위해 단백질 희석의 적절한 양을 준비합니다.
96웰 의 흰색 플레이트에서 각 우물에 분석 버퍼의 84 마이크로 리터를 분배합니다. 제어 반응을 준비하려면 플레이트의 첫 번째 열에 DMSO의 마이크로리터 1개를 추가합니다. 테스트된 화합물의 마이크로리터 1개를 추가하여 플레이트에 10 마이크로몰러의 최종 농도에 도달합니다.
프로테아제솔루션 당 5마이크로리터를 분배하고, 컨트롤을 제외한 플레이트를 섭씨 4°C에서 30분 동안 배양합니다. 반응을 시작하려면 불소 기판 스톡 용액 10 마이크로리터를 우물에 분배합니다. 적절한 매개 변수로 설정된 불소계를 사용하여 반응을 따르십시오.
이 세션의 경우 모든 시약은 DEPC 처리 된 물로 준비해야합니다. 폴리우리딘 RNA를 55°C에서 5분간 열 사이클러에서 배양하여 음. 얼음에 물질을 해동하고 분석 버퍼에서 250 나노 몰의 최종 농도에 도달하기 위해 단백질을 희석.
SYBR 그린 I 용액 분석 버퍼를 준비한 다음 ATP와 anealed RNA를 각각 1밀리머와 300 나노몰러의 최종 농도에 추가합니다. PCR 플레이트에서 희석된 단백질의 24.5 마이크로리터를 1내지 11럼에 넣습니다. 나머지 우물에 분석 버퍼의 동일한 볼륨을 추가합니다.
화합물 및 컨트롤의 우물 당 0.5 마이크로 리터를 추가하여 10 마이크로 몰러의 최종 농도에 도달합니다. 15분 배양 후 기판 용액의 25마이크로리터를 추가하여 반응을 시작하고 플레이트를 밀봉한다. FAM 필터를 사용하여 30섭에서 배양된 실시간 PCR 시스템에서 반응을 따르십시오.
도 1A에서, 우리는 Zika 바이러스 성 레플리카 세포주를 얻기 위하여 개발된 RNA 구조의 회로도 표현을 보고, Rluc 유전자가 구조 서열 및 IRES 새로운 카세트를 3'엔드에 삽입했다는 것을 보여주는. 또한 체외 전사및 본격적인 3'end 및 RNA 전사체의 생성을 위한 델타 형 간염 바이러스 리보지메 서열에서 T7 프로모터를 각각 포함한다. 그림 1B에서, 우리는 레플리턴 기반 세포 분석의 회로도 표현을 참조하십시오.
도 1C에서, 우리는 Rluc replicon 시스템을 사용하여 얻은 주어진 화합물의 투여 반응 곡선 및 세포 독성 곡선을 본다. 그림 2A에서 NS2B-NS3 프로테아제의 활성을 결정하는 데 사용되는 분석법의 회로도 표현을 볼 수 있습니다. 도 2B에서, 우리는 NS2B-NS3 프로테아이를 대상으로 주어진 억제제의 용량 반응 곡선을 참조하십시오.
그림 2C에서 NS5 RdRp 활동을 결정하는 데 사용되는 신장 분석법의 회로도 표현을 볼 수 있습니다. 그림 2D에서, 우리는 Zika 바이러스 RdRp 활동을 표적으로 하는 주어진 억제제의 복용량 반응 단을 봅니다. 입증 된 절차는 384 또는 1, 536 웰 형식으로 상영을 위해 쉽게 적응 할 수 있습니다.
레플리콘 기반의 고처리량 스크리닝을 위해, 우리는 5'end에서 레닐라 루시파라제 서열을 포함하는 복제 Zika 바이러스 보충을 품고 있는 안정된 세포주, 또한 3'말의 내부 리보소말 진입 부위에 의해 구동되는 신마이신 인트랜스퍼라제 유전자를 개발했습니다. 구조적인 유전자의 부족으로 인해, 레플리톤은 자손 의 비약을 생성하지 않습니다. 따라서, 실험실의 위험을 제거 하여 바이러스 감염을 획득.
또한, 우리는 또한 재조합 NS3 프로테아제 및 NS5 RdRp에 대한 바이러스 효소 기반 의 소법에 사용되는 절차를 시연했다. 바이러스 성 프로테아제의 프로테오리틱 활성은 불소 펩티드 기판을 사용하여 측정되었으며, 이는 지카 바이러스 프로테아제 인식 및 분열 서열을 포함하는 형광 주 아미노메틸쿠마린과 결합되었다. NS5 RNA 의존 RNA 폴리머라제와 관련하여, SYBR Green I.의 형광 신호의 증가에 의해 신장 활성이 직접 검출되고, 직접 측정 및 경제성은 고처리량 스크리닝 플랫폼으로서 사용자의 플로레스션 기반 방법의 핵심 포인트이다.
