המטרה הכוללת של הליכים אלה היא לסנן מעכבים של שכפול וירוס זיקה בפורמט הקרנה תפוקה גבוהה, באמצעות replicon מבוסס ו / או בדיקות מבוססות אנזים ויראלי. גילוי תרופות אנטי-ויראליות דורש פיתוח של בדיקות תאיות וביוכימיות אמינות שניתן לבצע בפורמטים של סינון בעל תפוקה גבוהה. הקרנות מבוססות Replicon ובדיקות ויראליות מבוססות אנזימים הן שתי אסטרטגיות חשובות לבדיקת תרכובות מולקולה קטנות כמעכבים של וירוס זיקה.
replicons הם מערכות תת-גנומיות המשכפלות את עצמם המתבטאות בתאי יונקים שבהם הגנים המבניים הנגיפיים מוחלפים בגן עיתונאי. במעבדה שלנו, פיתחנו מערכת שחזור של וירוס זיקה, כולל הלוציפראז של רנילה, המתבטאת ביציבות בקווי תאים של אוגר תינוקות BHK-21. ההשפעות המעכבות של תרכובות על שכפול RNA ויראלי ניתן להעריך בקלות על ידי מדידת הירידה בפעילות לוציפראז.
כדי לאפיין את המטרות הספציפיות של תרכובות מזוהות, הקמנו בדיקות מבוססות פלואורסצנטיות במבחנה עבור פרוטאז NS3 המובעים מחדש ו- RNA פולימראז תלוי NS5, RdRp. התחל על ידי פולחן תאי replicon ויראלי זיקה עד שהם מגיעים 70 עד 90 אחוז מפגש. בזרימה למינאר סטרילית, להסיר ולהשליך את המדיה מן הבקבוקון.
תוסיף 5 מיל של טריפסין-EDTA לבקבוקון. מורחים את תמיסה טריפסין על התאים ולהשאיר את הבקבוק במשך חמש עד 10 דקות עבור תאים לנתק. לקצור את התאים resuspended ומניחים אותו בצינור סטרילי 50 מיל וצנטריפוגה אותו עבור 125G במהלך חמש דקות.
לאחר השלכת supernatant, resuspend התאים בחמש מיל של DMEM 10%FBS לספירה. התאימו את התאים ל-10 עד 4 לבאר וזרעו אותם בצלחת של 96 בארות. לאחר מכן לדגור על הצלחת במשך 16 שעות ב 37 צלזיוס בחממה מכשיר אדים CO2.
לאחר מכן, בטל את המדיום והוסף 100 מיקרוליטרים לבאר של DMEM 2%FBS. הוסף microliter אחד של המתחם לבאר כדי לגרום לריכוז הסופי של 10 micromolar ו 1%DMSO במדיום אסאי. בעמודה הראשונה ובעמודה האחרונה, הכן את השליטה החיובית והשלילית.
לדגור על הצלחת במשך 48 שעות ב 37 צלזיוס בחממה מכשיר אדים CO2. הכן רנילה לוציפראז חיץ תמוגה ריאגנט על פי הוראות הייצור. לאחר השלכת supernatant מן התאים להוסיף 25 microliters של רנילה לוציפראז חיץ ליז לכל באר.
הוסיפו 100 מיקרוליטרים של רינילה לוציפראז אסאי ריאגנט לבאר לצלחת לבנה אטומה של 96 בארות. מעבירים 20 מיקרוליטרים של התא ליסייט ללוח הלבן ולאחר מכן לקרוא את אותות הזוהר בלומינומטר. עבור בדיקת MTT, ההליך הוכיח בעבר ולאחר דגירה מורכבת להוסיף 10 microliters לכל באר של פתרון MTT לתאים ולדגירה את הצלחת ב 37 צלזיוס במדריך אדים CO2 במשך 24 שעות.
השליכו את הסופר-נט והוסיפו 100 מיקרוליטרים של DMSO לכל באר, ולאחר מכן השליכו את גבישי הפורמזן על ידי צנרת למעלה ולמטה. קרא את הספיגה ב 570 ננומטר בספקטרופוטומטר. לאחר הפשרת חומרים על קרח, להכין כמות מתאימה של דילול חלבון כדי להגיע לריכוז הסופי של ארבעה ננומולר לבאר.
בצלחת לבנה 96-well, לחלק 84 microliters של חוצץ assay בכל באר. כדי להכין תגובת בקרה, הוסף מיקרו-ליטר אחד של DMSO לעמודה הראשונה של הלוח. הוסף microliter אחד של תרכובות שנבדקו כדי להגיע לריכוז הסופי של 10 micromolar לצלחת.
מחלקים חמישה מיקרוליטרים לבאר של תמיסת פרוטאז, למעט בקרות ודגרת הצלחת בארבעה צלסיוס למשך 30 דקות. כדי להתחיל את התגובה, לחלק 10 microliters של פתרון מלאי מצע פלואורוגניים לבארות. בצע את התגובה שלהם באמצעות פלואורומטר להגדיר בפרמטרים המתאימים.
עבור מושב זה, כל הריאגנטים חייבים להיות מוכנים עם DEPC טיפול במים. אנאל RNA פוליאורידין על ידי דגירה זה ב 55 צלזיוס במשך חמש דקות ב אופניים תרמיים. להפשיר חומרים על קרח ותדלל את החלבון כדי להגיע לריכוז סופי של 250 ננומולר במאגר ההסתה.
הכן את חיץ ה- SYBR Green I, ולאחר מכן הוסף ATP ואת ה- RNA המושחת לריכוז סופי של מילימולר אחד ו -300 ננומולר, בהתאמה. בצלחת PCR, הוסף 24.5 מיקרוליטרים של החלבון מדולל בעמודות 1 עד 11. הוסף את אותו נפח של מאגר ה- assay בבארות הנותרות.
הוסף 0.5 מיקרוליטרים לבאר של תרכובות ובקרות כדי להגיע לריכוז סופי של 10 מיקרומולר. לאחר 15 דקות דגירה, להתחיל את התגובה על ידי הוספת 25 microliters של פתרון המצע ולאטום את הצלחת. עקבו אחר התגובה במערכת PCR בזמן אמת המודגרת ב-30 מעלות צלזיוס באמצעות מסנן FAM.
באיור 1A, אנו רואים ייצוג סכמטי של מבנה הרנ"א שפותח כדי להשיג קווי תאי replicon ויראלי זיקה, מראה כי הגן Rluc מחליף את הרצפים המבניים ואת הקלטת החדשה IRES מוכנס בסוף 3 '. הוא כולל גם מקדם T7 ברצף ריבוזים וירוס דלתא הפטיטיס עבור תמלול במבחנה וליצירת 3'סוף אותנטי ותעתיק RNA, בהתאמה. באיור 1B, אנו רואים ייצוג סכמטי של תא מבוסס replicon.
באיור 1C, אנו רואים את עקומות תגובת המינון ואת עקומות הציטוטוקסיות של תרכובת נתונה המתקבלת באמצעות מערכת replicon Rluc. באיור 2A, אנו רואים ייצוג סכמטי של ההסתה המשמשת לקביעת הפעילות של הפרוטאז NS2B-NS3. באיור 2B, אנו רואים את עקומת תגובת המינון של מעכב נתון המתמקד בפרוטאז NS2B-NS3.
באיור 2C, אנו רואים ייצוג סכמטי של מבחן התארכות המשמש לקביעת פעילות NS5 RdRp. באיור 2D, אנו רואים את קבוצת תגובת המינון של מעכב נתון מיקוד פעילות RdRp וירוס זיקה. ניתן להתאים את ההליכים המודגמים בקלות להקרנות בפורמטים של 384 או 1, 536-well.
עבור הקרנות תפוקה גבוהה מבוססות replicon, פיתחנו קו תא יציב מחסה replicon וירוס זיקה משוכפל המכיל רצף רנילה לוציפראז בקצה 5', וגם גן ניאופופרנספראז neomycin מונע על ידי אתר כניסה ריבוזומלי פנימי בקצה 3'. בשל היעדר גנים מבניים, replicons אינם מייצרים virions צאצאים. לכן, ביטול הסיכון של זיהום ויראלי נרכש במעבדה.
בנוסף, הדגמנו גם את ההליכים המשמשים בדיקות מבוססות אנזימים ויראליים עבור פרוטאז NS3 רקומביננטי ו- NS5 RdRp. הפעילות הפרוטאוליטית של הפרוטאז הנגיפי נמדדה באמצעות מצע פפטיד פלואורוגני, המכיל את זיהוי הפרוטאז של נגיף זיקה ורצפי מחשוף בשילוב עם מלאי הפלואורסצנטי aminomethylcoumarin. לגבי RNA פולימראז תלוי NS5, פעילות התארכות שלה מזוהה ישירות על ידי הגידול של אות הפלואורסצנטי של SYBR Green I.אלה יישום, מדידה ישירה, ובמחיר סביר הם נקודות מפתח לשיטות מבוססות פלורסנט של המשתמש כפלטפורמות הקרנה תפוקה גבוהה.
