Das übergeordnete Ziel dieser Verfahren ist es, in einem Hochdurchsatz-Screening-Format mit einem replikonbasierten und/oder einem viralen Enzym-basierten Assay nach Inhibitoren der Zika-Virusreplikation zu suchen. Die Entdeckung antiviraler Medikamente erfordert die Entwicklung zuverlässiger zellulärer und biochemischer Assays, die in Hochdurchsatz-Screening-Formaten durchgeführt werden können. Replicon-basierte Screenings und virale Enzym-basierte Assays sind zwei wertvolle Strategien, um niedermolekulare Verbindungen als Inhibitoren des Zika-Virus zu testen.
Replicons sind selbstreplizierende subgenomische Systeme, die in Säugetierzellen exprimiert werden, in denen die viralen Strukturgene durch ein Reportergen ersetzt werden. In unserem Labor haben wir ein Zika-Virus-Replicon-System entwickelt, einschließlich der Renilla-Luciferase, die stabil in Babyhamster-BHK-21-Zelllinien exprimiert wird. Die hemmenden Wirkungen von Verbindungen auf die virale RNA-Replikation können leicht bewertet werden, indem die Verringerung der Luciferase-Aktivität gemessen wird.
Um die spezifischen Ziele der identifizierten Verbindungen zu charakterisieren, haben wir in vitro fluoreszenzbasierte Assays für rekombinant exprimierte NS3-Protease und NS5-RNA-abhängige RNA-Polymerase, die RdRp, etabliert. In einem sterilen laminaren Fluss das Medium aus dem Kolben entfernen und entsorgen.
Fügen Sie fünf Mil Trypsin-EDTA in den Kolben hinzu. Verteilen Sie die Trypsinlösung über die Zellen und lassen Sie den Kolben fünf bis 10 Minuten stehen, damit sich die Zellen lösen können. Ernten Sie die resuspendierten Zellen und legen Sie sie in das sterile 50-mil-Röhrchen und zentrifugieren Sie es für 125G während fünf Minuten.
Nachdem Sie den Überstand verworfen haben, resuspendieren Sie die Zellen in fünf Mil DMEM 10% FBS zum Zählen. Stellen Sie die Zellen auf zwei Mal 10 bis vier pro Vertiefung ein und säen Sie sie in einer 96-Well-Platte. Anschließend wird die Platte 16 Stunden bei 37 Grad Celsius in einem CO2-Luftbefeuchter-Inkubator inkubiert.
Als nächstes verwerfen Sie das Medium und fügen Sie 100 Mikroliter pro Vertiefung von DMEM 2% FBS hinzu. Fügen Sie einen Mikroliter der Verbindung pro Vertiefung hinzu, um eine Endkonzentration von 10 Mikromolaren und 1% DMSO im Assay-Medium zu erhalten. Bereiten Sie in der ersten und in der letzten Spalte die Positiv- und Negativkontrolle vor.
Inkubieren Sie die Platte 48 Stunden lang bei 37 Grad Celsius in einem CO2-Luftbefeuchter-Inkubator. Bereiten Sie Renilla Luciferase Lysepuffer in Reagenz gemäß der Herstellungsanweisung vor. Nach dem Verwerfen des Überstands aus den Zellen fügen Sie 25 Mikroliter Renilla luciferase lyse Puffer pro Vertiefung hinzu.
100 Mikroliter Renilla Luciferase Assay-Reagenz pro Vertiefung zu einer weißen, undurchsichtigen 96-Well-Platte hinzufügen. Übertragen Sie 20 Mikroliter des Zelllysats auf die weiße Platte und lesen Sie dann die Lumineszenzsignale im Luminometer. Für den MTT-Assay wurde zuvor gezeigt, dass nach der Inkubation der Verbindung 10 Mikroliter pro Vertiefung MTT-Lösung zu den Zellen hinzugefügt und die Platte bei 37 Grad Celsius in einem CO2-Luftbefeuchter für 24 Stunden inkubiert wird.
Verwerfen Sie den Überstand und fügen Sie 100 Mikroliter DMSO zu jeder Vertiefung hinzu und lösen Sie dann die Formazankristalle durch Pipettieren nach oben und unten. Lesen Sie die Absorptionsmittel bei 570 Nanometern in einem Spektralphotometer ab. Bereiten Sie nach dem Auftauen von Materialien auf Eis eine geeignete Menge an Proteinverdünnung vor, um eine Endkonzentration von vier Nanomolaren pro Vertiefung zu erreichen.
Geben Sie in einer weißen Platte mit 96 Wellen 84 Mikroliter des Assay-Puffers in jede Vertiefung. Um eine Kontrollreaktion vorzubereiten, fügen Sie ein Mikroliter DMSO in die erste Säule der Platte hinzu. Fügen Sie einen Mikroliter der getesteten Verbindungen hinzu, um eine Endkonzentration von 10 Mikromolaren auf der Platte zu erreichen.
Geben Sie fünf Mikroliter pro Vertiefung pro Proteaselösung, ohne Kontrollen, und inkubieren Sie die Platte bei vier Grad Celsius für 30 Minuten. Um die Reaktion zu starten, dosieren Sie 10 Mikroliter fluorogene Substrat-Stammlösung in die Vertiefungen. Verfolgen Sie ihre Reaktion mit einem Fluorometer, das in geeigneten Parametern eingestellt ist.
Für diese Sitzung müssen alle Reagenzien mit DEPC-behandeltem Wasser vorbereitet werden. Glühen Sie die Polyuridin-RNA, indem Sie sie bei 55 Grad Celsius für fünf Minuten in einem Thermocycler inkubieren. Auftauen Sie Materialien auf Eis und verdünnen Sie das Protein, um eine Endkonzentration von 250 Nanomolaren im Assay-Puffer zu erreichen.
Bereiten Sie den SYBR Green I Lösungsassaypuffer vor und fügen Sie dann ATP und die anealierte RNA zu einer Endkonzentration von einem Millimolar bzw. 300 Nanomolar hinzu. In einer PCR-Platte werden 24,5 Mikroliter des verdünnten Proteins in den Spalten eins bis 11 hinzugefügt. Fügen Sie das gleiche Volumen des Assay-Puffers in den verbleibenden Bohrungen hinzu.
Fügen Sie 0,5 Mikroliter pro Vertiefung von Verbindungen und Kontrollen hinzu, um eine Endkonzentration von 10 Mikromolaren zu erreichen. Nach 15 Minuten Inkubation beginnen Sie die Reaktion, indem Sie 25 Mikroliter der Substratlösung hinzufügen und die Platte versiegeln. Verfolgen Sie die Reaktion in einem Echtzeit-PCR-System, das bei 30 Grad Celsius mit einem FAM-Filter inkubiert wird.
In Abbildung 1A sehen wir eine schematische Darstellung des RNA-Konstrukts, das entwickelt wurde, um Zika-Viral-Replicon-Zelllinien zu erhalten, und zeigen, dass das Rluc-Gen die strukturellen Sequenzen ersetzt und die neue IRES-Kassette am 3'-Ende eingefügt wird. Es enthält auch einen T7-Promotor in der Hepatitis-Delta-Virus-Ribozym-Sequenz für die In-vitro-Transkription und für die Generierung des authentischen 3'-Endes bzw. des RNA-Transkripts. In Abbildung 1B sehen wir eine schematische Darstellung des replicon-basierten Zellassays.
In Abbildung 1C sehen wir die Dosis-Wirkungs-Kurven und die Zytotoxizitätskurven einer bestimmten Verbindung, die mit dem Rluc-Replicon-System erhalten wurden. In Abbildung 2A sehen wir eine schematische Darstellung des Assays, der zur Bestimmung der Aktivität der NS2B-NS3-Protease verwendet wird. In Abbildung 2B sehen wir die Dosis-Wirkungs-Kurve eines bestimmten Inhibitors, der auf die NS2B-NS3-Protease abzielt.
In Abbildung 2C sehen wir eine schematische Darstellung des Dehnungstests, der zur Bestimmung der NS5 RdRp-Aktivität verwendet wird. In Abbildung 2D sehen wir die Dosis-Wirkungs-Gruppe eines bestimmten Inhibitors, der auf die RdRp-Aktivität des Zika-Virus abzielt. Die demonstrierten Verfahren konnten leicht für Screenings in einem 384- oder 1.536-Well-Format angepasst werden.
Für die replikonbasierten Hochdurchsatz-Screenings entwickelten wir eine stabile Zelllinie, die ein replikatives Zika-Virusreplikon beherbergt, das eine Renilla-Luciferase-Sequenz am 5'-Ende enthält, sowie ein Neomycin-Phosphotransferase-Gen, das von einer internen ribosomalen Eintrittsstelle am 3'-Ende angetrieben wird. Aufgrund des Mangels an strukturellen Genen produzieren Replikone keine Nachkommenvirionen. Somit wird das Risiko einer im Labor erworbenen Virusinfektion eliminiert.
Darüber hinaus demonstrierten wir auch die Verfahren, die in viralen enzymbasierten Assays für die rekombinante NS3-Protease und NS5 RdRp verwendet werden. Die proteolytische Aktivität der viralen Protease wurde mit einem fluorogenen Peptidsubstrat gemessen, das die Zika-Virus-Protease-Erkennungs- und Spaltsequenzen in Verbindung mit dem Fluoreszenzstock-Aminomethylcumarin enthält. In Bezug auf die NS5-RNA-abhängige RNA-Polymerase wird ihre Dehnungsaktivität direkt durch die Erhöhung des fluoreszierenden Signals von SYBR Green I nachgewiesen.Diese Implementierung, direkte Messung und Erschwinglichkeit sind Schlüsselpunkte für die floreszenzbasierten Methoden des Benutzers als Hochdurchsatz-Screening-Plattformen.
