L'obiettivo generale di queste procedure è quello di esaminare gli inibitori della replicazione del virus Zika in un formato di screening ad alto rendimento, utilizzando saggi basati su replicon e / o un enzima virale. La scoperta di farmaci antivirali richiede lo sviluppo di saggi cellulari e biochimici affidabili che possono essere eseguiti in formati di screening ad alto rendimento. Gli screening basati su Replicon e i saggi basati su enzimi virali sono due strategie preziose per testare composti di piccole molecole come inibitori del virus Zika.
I repliconi sono sistemi subgenomici autoreplicanti espressi in cellule di mammifero in cui i geni strutturali virali sono sostituiti da un gene reporter. Nel nostro laboratorio, abbiamo sviluppato un sistema di replicon del virus Zika, tra cui la Renilla luciferasi, che è stabilmente espressa in linee cellulari BHK-21 di criceto. Gli effetti inibitori dei composti sulla replicazione dell'RNA virale possono essere facilmente valutati misurando la riduzione dell'attività della luciferasi.
Per caratterizzare i bersagli specifici dei composti identificati, abbiamo stabilito saggi in vitro basati sulla fluorescenza per la proteasi NS3 espressa in modo ricombinante e l'RNA polimerasi NS5 RNA-dipendente, il RdRp. Inizia coltivando cellule replicon virali Zika fino a raggiungere il 70-90% di confluenza. In un flusso laminare sterile, rimuovere ed eliminare il mezzo dal pallone.
Aggiungere cinque mils di tripsina-EDTA al pallone. Distribuire la soluzione di tripsina sulle cellule e lasciare il matraccio per cinque-10 minuti affinché le cellule si stacchino. Raccogliere le cellule riaspense e metterle nel tubo sterile da 50 mil e centrifugarle per 125G per cinque minuti.
Dopo aver scartato il surnatante, risusegnare le cellule in cinque mils di DMEM 10% FBS per il conteggio. Regolare le cellule a due volte da 10 a quattro per pozzetti e seminarle in un piatto da 96 pozzetti. Quindi incubare la piastra per 16 ore a 37 gradi Celsius in un incubatore di umidificatore a CO2.
Quindi scartare il mezzo e aggiungere 100 microlitri per pozzo di DMEM 2% FBS. Aggiungere un microlitro del composto per pozzetto per provocare una concentrazione finale di 10 micromolari e 1% DMSO nel mezzo di saggio. Nella prima e nell'ultima colonna, preparare il controllo positivo e negativo.
Incubare la piastra per 48 ore a 37 gradi Celsius in un incubatore di umidificatore a CO2. Preparare il tampone di lisi della renilla luciferasi nel reagente secondo le istruzioni di fabbricazione. Dopo aver scartato il surnatante dalle cellule aggiungere 25 microlitri di tampone di lyse renilla luciferasi per pozzo.
Aggiungere 100 microlitri di reagente per il dosaggio della renilla luciferasi per pozzettino a una piastra bianca opaca da 96 pozzetti. Trasferire 20 microlitri del lisato cellulare alla piastra bianca e quindi leggere i segnali di luminescenza nel luminometro. Per il test MTT, la procedura è stata precedentemente dimostrata e dopo l'incubazione del composto aggiungere 10 microlitri per pozzetto di soluzione MTT alle cellule e incubare la piastra a 37 gradi Celsius in un umidificatore a CO2 per 24 ore.
Scartare il surnatante e aggiungere 100 microlitri di DMSO a ciascun pozzo, quindi solubilizzare i cristalli di formazan tubando su e giù. Leggi gli assorbenti a 570 nanometri in uno spettrofotometro. Dopo aver scongelato i materiali sul ghiaccio, preparare una quantità appropriata di diluizione proteica per raggiungere una concentrazione finale di quattro nanomolari per pozzetto.
In una piastra bianca a 96 pozzetti, erogare 84 microlitri del tampone di dosaggio in ciascun pozzettino. Per preparare una reazione di controllo, aggiungere un microlitro di DMSO alla prima colonna della piastra. Aggiungere un microlitro dei composti testati per raggiungere una concentrazione finale di 10 micromolari alla piastra.
Erogare cinque microlitri per pozzo di soluzione di proteasi, esclusi i controlli e incubare la piastra a quattro gradi Celsius per 30 minuti. Per avviare la reazione, erogare 10 microlitri di soluzione stock di substrato fluorogenico ai pozzi. Seguire la loro reazione utilizzando un fluorometro impostato in parametri appropriati.
Per questa sessione, tutti i reagenti devono essere preparati con acqua trattata DEPC. Ricottura dell'RNA poliuridina incubandolo a 55 gradi Celsius per cinque minuti in un ciclo termico. Scongelare i materiali sul ghiaccio e diluire la proteina per raggiungere una concentrazione finale di 250 nanomolari nel tampone di dosaggio.
Preparare il tampone di dosaggio della soluzione SYBR Green I, quindi aggiungere ATP e l'RNA anealed a una concentrazione finale di un millimolare e 300 nanomolari, rispettivamente. In una piastra PCR, aggiungere 24,5 microlitri della proteina diluita nelle colonne da uno a 11. Aggiungere lo stesso volume del tampone di dosaggio nei pozzi rimanenti.
Aggiungere 0,5 microlitri per pozzet di composti e controlli per raggiungere una concentrazione finale di 10 micromolari. Dopo 15 minuti di incubazione, iniziare la reazione aggiungendo 25 microlitri della soluzione di substrato e sigillare la piastra. Seguire la reazione in un sistema PCR in tempo reale incubato a 30 gradi Celsius utilizzando un filtro FAM.
Nella figura 1A, vediamo una rappresentazione schematica del costrutto di RNA sviluppato per ottenere linee cellulari replicon virali Zika, mostrando che il gene Rluc sostituisce le sequenze strutturali e la nuova cassetta IRES inserita a 3'end. Include anche un promotore T7 nella sequenza ribozima del virus delta dell'epatite per la trascrizione in vitro e per la generazione dell'estremità 3'e del trascritto RNA autentici, rispettivamente. Nella figura 1B, vediamo una rappresentazione schematica del saggio cellulare basato su replicon.
Nella figura 1C, vediamo le curve dose-risposta e le curve di citotossicità di un dato composto ottenute utilizzando il sistema Rluc replicon. Nella figura 2A, vediamo una rappresentazione schematica del saggio utilizzato per determinare l'attività della proteasi NS2B-NS3. Nella figura 2B, vediamo la curva dose-risposta di un dato inibitore che prende di mira la proteasi NS2B-NS3.
Nella figura 2C, vediamo una rappresentazione schematica del saggio di allungamento utilizzato per determinare l'attività NS5 RdRp. Nella figura 2D, vediamo il gruppo dose-risposta di un dato inibitore che prende di mira l'attività RdRp del virus Zika. Le procedure dimostrate potrebbero essere prontamente adattate per le proiezioni in un formato 384 o 1, 536-well.
Per gli screening ad alto rendimento basati su replicon, abbiamo sviluppato una linea cellulare stabile che ospita un replicon replicativo del virus Zika contenente una sequenza di Renilla luciferasi all'estremità 5', e anche un gene della neomicina fosfotransferasi guidato da un sito di ingresso ribosomiale interno all'estremità 3'. A causa della mancanza di geni strutturali, i repliconi non producono virioni di progenie. Pertanto, eliminando il rischio di infezione virale acquisita in laboratorio.
Inoltre, abbiamo anche dimostrato le procedure utilizzate nei saggi basati su enzimi virali per la proteasi NS3 ricombinante e NS5 RdRp. L'attività proteolitica della proteasi virale è stata misurata utilizzando un substrato peptidico fluorogenico, che contiene il riconoscimento della proteasi del virus Zika e sequenze di scissione accoppiate con l'aminometilcumarina di fluorescenza. Per quanto riguarda l'RNA polimerasi NS5 RNA-dipendente, la sua attività di allungamento è rilevata direttamente dall'aumento del segnale fluorescente di SYBR Green I.Queste implementazioni, misurazioni dirette e convenienza sono punti chiave per i metodi basati sulla florescenza dell'utente come piattaforme di screening ad alto rendimento.
