这些程序的总体目标是使用基于复述和/或基于病毒酶的检测，以高通量筛选格式筛选寨卡病毒复制的抑制剂。抗病毒药物的发现需要开发可靠的细胞和生化检测，可以以高通量筛选格式进行。基于 Replicon 的筛查和基于病毒酶的检测是测试小分子化合物作为寨卡病毒抑制剂的两种有价值的策略。
复制物是哺乳动物细胞中表达的自复制亚基因组系统，其中病毒结构基因被报告基因取代。在我们的实验室中，我们开发了寨卡病毒再利康系统，包括蕾妮拉红斑，它稳定地表达在婴儿仓鼠BHK-21细胞系中。化合物对病毒RNA复制的抑制作用可以通过测量葡萄糖酶活性的减少来轻松评估。
为了描述所识别化合物的具体目标，我们建立了体外荧光检测，用于重组表达NS3蛋白酶和NS5依赖RNA聚合酶RdRp.从培养寨卡病毒复方细胞开始，直到它们达到70%至90%的汇合。在无菌层压流中，从烧瓶中取出并丢弃介质。
在烧瓶中加入五英里。将试金素溶液铺在细胞上，将烧瓶离开5至10分钟，让细胞分离。收获重新悬浮的细胞，并将其放入无菌的5000万米管中，并在5分钟内离心125G。
丢弃超高分子后，将细胞重新吸收到五英里（10%FBS）的DMEM中进行计数。将细胞调整到每口井2倍10至4次，并在96井盘中播种。然后在 CO2 加湿器孵化器中在 37 摄氏度下孵育板 16 小时。
接下来丢弃介质，每口DMEM 2%FBS添加100微升。每口井加入一微升化合物，最终在检测介质中浓度为10微摩尔和1%DMSO。在第一列和第末列中，准备正负对照。
在 CO2 加湿器孵化器中，在 37 摄氏度下孵育板 48 小时。根据制造说明，在试剂中准备雷尼拉葡萄糖裂解缓冲器。从细胞中丢弃超纳特后，每口井加入25微升的雷尼拉葡萄糖裂解缓冲器。
将每口油井100微升的雷尼拉葡萄糖检测试剂加入白色不透明的96井板中。将细胞裂解物的20微升转移到白板上，然后在发光仪中读取发光信号。对于 MTT 检测，程序以前已经证明，在复合孵化后，每口 MTT 溶液在细胞中加入 10 微升，并在 CO2 加湿器中在 37 摄氏度下孵育板 24 小时。
丢弃超高分子，在每口井中加入100微升DMSO，然后通过上下管道使福马赞晶体溶化。在光谱光度计中读取 570 纳米的吸气剂。在冰上解冻材料后，准备适量的蛋白质稀释，以达到每口井四纳米摩尔的最终浓度。
在 96 井的白色板中，在每口油井中分配 84 微升的检测缓冲器。要准备控制反应，在板的第一列中加入一微升 DMSO。加入一个微升的测试化合物，以达到10微摩尔的最终浓度到板。
每口蛋白酶溶液分配5微升，排除控制，在4摄氏度下孵育板30分钟。为了开始反应，向井中分配10微升荧光基板库存溶液。使用以适当参数设置的荧二度计跟踪他们的反应。
对于本届会议，所有试剂都必须用 DEPC 处理过的水准备。在热循环器中在55摄氏度下孵育5分钟，使多尿素RNA处于Anneal。在冰上解冻材料并稀释蛋白质，最终浓度达到250纳米摩尔在检测缓冲器中。
准备SYBR Green I溶液检测缓冲器，然后将ATP和麻醉RNA分别添加到1毫摩尔和300纳米摩尔的最终浓度中。在PCR板中，在1到11列中加入24.5微升稀释蛋白。在剩余的油井中添加相同体积的检测缓冲。
每口井添加0.5微升化合物和对照剂，最终浓度达到10微摩尔。孵化15分钟后，加入25微升基板溶液并密封板，开始反应。使用 FAM 过滤器在 30 摄氏度下孵育的实时 PCR 系统中跟踪反应。
在图1A中，我们看到为获得寨卡病毒复方细胞系而开发的RNA结构的示意图表示，显示 Rluc 基因取代了结构序列，IRES 新盒式磁带插入 3'end。它还包括在肝炎三角洲病毒核糖酶序列的T7促进体外转录和生成正宗的3'end和RNA转录，分别。在图 1B 中，我们看到基于 replicon 的细胞检测的示意图表示。
在图1C中，我们看到使用 Rluc replicon 系统获得的给定化合物的剂量反应曲线和细胞毒性曲线。在图 2A 中，我们看到用于确定 NS2B-NS3 蛋白酶活动的检测示意图。在图 2B 中，我们看到针对 NS2B-NS3 蛋白酶的给定抑制剂的剂量响应曲线。
在图 2C 中，我们看到用于确定 NS5 RdRp 活动的拉长测定的示意图表示。在图2D中，我们看到针对寨卡病毒RdRp活动的给定抑制剂的剂量反应组。所证明的程序可以很容易地适应384或1，536井格式的筛选。
对于基于雷普利肯的高通量筛选，我们开发了一个稳定的细胞系，其中含有雷尼拉葡萄球菌酶序列的复制寨卡病毒再增殖体在5'end，以及一个由3'end内部核糖体入口部位驱动的新霉素磷转移酶基因。由于缺乏结构基因，再造物不会产生后代。因此，消除实验室获得病毒感染的风险。
此外，我们还演示了病毒酶基检测中用于重组NS3蛋白酶和NS5 RdRp的程序。病毒蛋白酶的蛋白酶的蛋白酶活性是使用荧光肽基板测量的，该基板包含寨卡病毒蛋白酶识别和序列，以及荧光库存阿米诺米基库马林。关于NS5依赖RNA聚合酶，其拉长活性直接通过SYBR Green I荧光信号的增加来检测。 这些实现、直接测量和可负担性是用户作为高通量筛选平台的荧光方法的关键点。
