O objetivo geral desses procedimentos é testar os inibidores da replicação do vírus Zika em um formato de triagem de alto rendimento, usando um ensaio baseado em replicon e/ou uma enzima viral. A descoberta de medicamentos antivirais requer o desenvolvimento de ensaios celulares e bioquímicos confiáveis que podem ser realizados em formatos de triagem de alto rendimento. Triagens baseadas em replicon e ensaios baseados em enzimas virais são duas estratégias valiosas para testar pequenos compostos de moléculas como inibidores do vírus Zika.
Os replicons são sistemas subgenômicos auto-replicante expressos em células mamíferas nas quais os genes estruturais virais são substituídos por um gene repórter. Em nosso laboratório, desenvolvemos um sistema de replicon do vírus Zika, incluindo a luciferase Renilla, que é expressa stably em linhas celulares bhk-21 do bebê. Os efeitos inibitórios dos compostos na replicação viral do RNA podem ser facilmente avaliados medindo a redução da atividade da luciferase.
Para caracterizar os alvos específicos dos compostos identificados, estabelecemos ensaios in vitro baseados em fluorescência para polimerase ns3 e ns5 RNA dependente de RNA, o RdRp. Start por cultivar células de replicon viral zika até atingir 70 a 90% de confluência. Em um fluxo laminar estéril, remova e descarte a mídia do frasco.
Adicione cinco mil de trypsin-EDTA ao frasco. Espalhe a solução de trippsina sobre as células e deixe o frasco por cinco a 10 minutos para que as células se desprendem. Colher as células resuspended e colocá-la no tubo estéril de 50 mil e centrífugue-as por 125G durante cinco minutos.
Depois de descartar o supernasce, resuspenque as células em cinco mil de DMEM 10% FBS para contagem. Ajuste as células para duas vezes 10 a 4 por poço e semee-as em uma placa de 96 poços. Em seguida, incubar a placa por 16 horas a 37 celsius em uma incubadora de umidificador de CO2.
Em seguida, descarte o meio e adicione 100 microliters por poço de DMEM 2%FBS. Adicione um microliter do composto por poço para resultar em uma concentração final de 10 micromolar e 1% DMSO no meio de ensaio. Na primeira e na última coluna, prepare o controle positivo e negativo.
Incubar a placa por 48 horas a 37 celsius em uma incubadora de umidificador de CO2. Prepare o tampão de lise de luciferase renilla em reagente de acordo com as instruções de fabricação. Depois de descartar o supernacido das células adicione 25 microlitadores de tampão de lise de luciferase renilla por poço.
Adicione 100 microliters de reagente de ensaio de luciferase Renilla por poço a uma placa branca opaca de 96 poços. Transfira 20 microlitros da placa de celulose para a placa branca e, em seguida, leia os sinais de luminescência no luminômetro. Para o ensaio MTT, o procedimento já demonstrou anteriormente e após a incubação composta adicionar 10 microliters por poço de solução MTT às células e incubar a placa a 37 celsius em um umidificador de CO2 por 24 horas.
Descarte o supernatante e adicione 100 microliters de DMSO a cada poço, e então solubilize os cristais formazan por pipetar para cima e para baixo. Leia os absorventes a 570 nanômetros em um espectrofotômetro. Após descongelar materiais no gelo, prepare uma quantidade apropriada de diluição proteica para alcançar uma concentração final de quatro nanomolar por poço.
Em uma placa branca de 96 poços, dispense 84 microliters do tampão de ensaio em cada poço. Para preparar uma reação de controle, adicione um microliter de DMSO à primeira coluna da placa. Adicione um microliter dos compostos testados para atingir uma concentração final de 10 micromolar à placa.
Dispense cinco microliters por poço de solução protease, excluindo controles e incubar a placa a quatro celsius por 30 minutos. Para iniciar a reação, dispense 10 microliters de solução fluorogênica de substrato para os poços. Siga sua reação usando um conjunto de fluorômetros em parâmetros apropriados.
Para esta sessão, todos os reagentes devem ser preparados com água tratada DEPC. Anneal o RNA de poliuridina incubando-o a 55 Celsius por cinco minutos em um cicloviário térmico. Descongele materiais no gelo e dilua a proteína para atingir uma concentração final de 250 nanomolar no tampão de ensaio.
Prepare o tampão de ensaio de solução SYBR Green I e, em seguida, adicione ATP e o RNA anealed a uma concentração final de um milimôlar e 300 nanomolar, respectivamente. Em uma placa PCR, adicione 24,5 microliters da proteína diluída nas colunas de um a 11. Adicione o mesmo volume do tampão de ensaio nos poços restantes.
Adicione 0,5 microliters por poço de compostos e controles para atingir uma concentração final de 10 micromolar. Após 15 minutos de incubação, inicie a reação adicionando 25 microliters da solução do substrato e seque a placa. Siga a reação em um sistema PCR em tempo real incubado a 30 Celsius usando um filtro FAM.
Na figura 1A, vemos uma representação esquemática do construto de RNA desenvolvido para obter linhas celulares de relíquias virais do Zika, mostrando que o gene Rluc substitui as sequências estruturais e o novo IRES inserido no final de 3'end. Ele também inclui um promotor T7 na sequência de ribozyme do vírus da hepatite delta para transcrição in vitro e para a geração da autêntica transcrição de 3'end e RNA, respectivamente. Na figura 1B, vemos uma representação esquemática do ensaio celular baseado em replicon.
Na figura 1C, vemos as curvas de dose-resposta e as curvas de citotoxicidade de um determinado composto obtido usando o sistema de replicon Rluc. Na figura 2A, vemos uma representação esquemática do ensaio utilizado para determinar a atividade do protease NS2B-NS3. Na figura 2B, vemos a curva dose-resposta de um determinado inibidor visando o protease NS2B-NS3.
Na figura 2C, vemos uma representação esquemática do ensaio de alongamento usado para determinar a atividade NS5 RdRp. Na figura 2D, vemos o grupo dose-resposta de um determinado inibidor visando a atividade do vírus Zika RdRp. Os procedimentos demonstrados poderiam ser prontamente adaptados para triagens em formatos 384 ou 1.536-well.
Para os triagens de alto rendimento baseadas em replicon, desenvolvemos uma linha celular estável abrigando um replicativo vírus Zika replicon contendo uma sequência de luciferase renilla no final de 5'end, e também um gene de fosfotransferase de neomicina impulsionado por um local de entrada ribossômico interno no final de 3'end. Devido à falta de genes estruturais, os replicons não produzem virions progêneres. Assim, eliminando o risco de infecção viral adquirida laboratorialmente.
Além disso, também demonstramos os procedimentos utilizados em ensaios baseados em enzimas virais para o recombinante NS3 protease e NS5 RdRp. A atividade proteolítica da protease viral foi medida pelo uso de um substrato de peptídeo fluorogênico, que contém o reconhecimento protease do vírus Zika e sequências de decote, juntamente com o estoque de fluorescência aminometilcoumarina. Em relação à polimerase RNA dependente do RNA NS5, sua atividade de alongamento é diretamente detectada pelo aumento do sinal fluorescente do SYBR Green I.Essas implementações, medição direta e acessibilidade são pontos-chave para os métodos baseados em floresnce do usuário como plataformas de triagem de alto rendimento.
