Bu prosedürlerin genel amacı, Zika virüsü replikasyonunun inhibitörlerini, replikon bazlı ve/veya viral enzim bazlı bir tahlil kullanarak yüksek verimli bir tarama formatında taramaktır. Antiviral ilaç keşfi, yüksek verimli tarama formatlarında gerçekleştirilebilecek güvenilir hücresel ve biyokimyasal tahlillerin geliştirilmesini gerektirir. Replikon bazlı taramalar ve viral enzim bazlı tahliller, küçük molekül bileşiklerini Zika virüsünün inhibitörleri olarak test etmek için iki değerli stratejidir.
Replikonlar, viral yapısal genlerin bir muhabir geni ile değiştirildiği memeli hücrelerinde ifade edilen kendi kendini çoğaltan subgenomik sistemlerdir. Laboratuvarımızda, bebek hamster BHK-21 hücre hatlarında saplanarak ifade edilen Renilla luciferaz da dahil olmak üzere bir Zika virüsü replikon sistemi geliştirdik. Bileşiklerin viral RNA replikasyon üzerindeki inhibitör etkileri, luciferaz aktivitesindeki azalma ölçülerek kolayca değerlendirilebilir.
Tanımlanan bileşiklerin spesifik hedeflerini karakterize etmek için, rekombinant olarak ifade edilen NS3 proteaz ve NS5 RNA bağımlı RNA polimeraz için in vitro floresan bazlı tahliller kurduk, RdRp. Zika viral replikon hücrelerini yüzde 70 ila 90 izdihama ulaşana kadar kült ederek başlayın. Steril bir laminar akışta, ortamı şişeden çıkarın ve atın.
Şişeye beş mil trypsin-EDTA ekleyin. Tripsin çözeltisini hücrelerin üzerine yayın ve hücrelerin ayrılması için şişeyi beş ila 10 dakika bekletin. Yeniden dirilen hücreleri hasat edin ve steril 50 mil tüpe yerleştirin ve beş dakika boyunca 125G santrifüjleyin.
Üstnatantı attıktan sonra, hücreleri sayım için beş mil DMEM%10 FBS'de yeniden biriktirin. Hücreleri kuyu başına iki kez 10 ila dört olarak ayarlayın ve 96 kuyu plakasına tohumlayın. Daha sonra plakayı 37 santigrat derecede 16 saat boyunca co2 nemlendirici inkübatörde kuluçkaya yatırın.
Daha sonra ortamı atın ve kuyu başına 100 mikrolitre DMEM 2%FBS ekleyin. Test ortamında 10 mikromoler ve% 1 DMSO'luk son konsantrasyonla sonuç vermek için kuyu başına bir mikroliter ekleyin. İlk ve son sütunda, pozitif ve negatif kontrolü hazırlayın.
Plakayı 37 santigrat derecede 48 saat boyunca co2 nemlendirici inkübatörde kuluçkaya yatırın. Renilla luciferaz lizis tamponu üretim talimatlarına göre reaktifte hazırlayın. Süpernatantı hücrelerden attıktan sonra kuyu başına 25 mikrolitre Renilla luciferase lyse tamponu ekleyin.
Beyaz opak 96 kuyu plakasına kuyu başına 100 mikrolitre Renilla luciferase test reaktifi ekleyin. Hücre lilatının 20 mikrolitresini beyaz plakaya aktarın ve ardından luminometredeki lüminesans sinyallerini okuyun. MTT tahlil için, prosedür daha önce göstermiştir ve bileşik inkübasyondan sonra hücrelere MTT çözeltisinin kuyusu başına 10 mikrolitre ekleyin ve plakayı 37 santigrat derecede bir CO2 nemlendiricide 24 saat boyunca kuluçkaya yatırın.
Süpernatantı atın ve her kuyuya 100 mikrolitre DMSO ekleyin ve ardından yukarı ve aşağı pipetleme yaparak formazan kristallerini çözün. Emicileri spektrofotometrede 570 nanometrede okuyun. Malzemeleri buz üzerinde çözdükten sonra, kuyu başına dört nanomolar nihai konsantrasyona ulaşmak için uygun miktarda protein seyreltme hazırlayın.
96 kuyulu beyaz bir plakada, her kuyuya 84 mikrolitre test tamponu dağıtın. Bir kontrol reaksiyonunu hazırlamak için plakanın ilk sütununa bir mikroliter DMSO ekleyin. Plakaya 10 mikromolar nihai konsantrasyona ulaşmak için test edilen bileşiklerden bir mikroliter ekleyin.
Kontroller hariç olmak üzere proteaz çözeltisinin kuyusu başına beş mikrolitre dağıtın ve plakayı 30 dakika boyunca dört santigrat derecede kuluçkaya bırakın. Reaksiyonu başlatmak için kuyulara 10 mikrolitre florojenik substrat stok çözeltisi dağıtın. Uygun parametrelerde ayarlanmış bir florometre kullanarak reaksiyonlarını takip edin.
Bu seans için tüm reaktifler DEPC arıtmalı su ile hazırlanmalıdır. Poliuridin RNA'yı bir termal çevrimde beş dakika boyunca 55 Santigrat derece inkübe ederek tavlayın. Malzemeleri buz üzerinde çözün ve proteini seyrelterek test tamponunda 250 nanomolar'lık son konsantrasyona ulaşın.
SYBR Green I çözelti tahlil tamponunu hazırlayın ve ardından SıRASıYLA bir milimolar ve 300 nanomolar son konsantrasyona ATP ve anealed RNA ekleyin. Bir PCR plakasında, seyreltilmiş proteinin 24,5 mikrolitresini sütunlara bir ila 11 ekleyin. Kalan kuyulara aynı miktarda test arabelleği ekleyin.
10 mikromolar nihai konsantrasyona ulaşmak için kuyu başına 0,5 mikrolitre bileşik ve kontrol ekleyin. 15 dakika kuluçkadan sonra, substrat çözeltisinin 25 mikrolitresini ekleyerek reaksiyona başlayın ve plakayı kapatın. Fam filtresi kullanarak 30 santigrat derecede inkübe edilmiş gerçek zamanlı bir PCR sistemindeki reaksiyonun ardından.
Şekil 1A'da, Zika viral replikon hücre hatlarını elde etmek için geliştirilen RNA yapının şematik bir temsilini görüyoruz, bu da Rluc geninin yapısal dizilerin ve 3'end'e yerleştirilen IRES yeni kasetinin yerini aldığını gösteriyor. Ayrıca in vitro transkripsiyon için hepatit delta virüs ribozim dizisinde ve sırasıyla otantik 3'end ve RNA transkriptinin üretimi için bir T7 promotörü içerir. Şekil 1B'de, replikon tabanlı hücre testinin şematik bir gösterimini görüyoruz.
Şekil 1C'de, Rluc replicon sistemi kullanılarak elde edilen belirli bir bileşiğin doz-tepki eğrilerini ve sitotoksiklik eğrilerini görüyoruz. Şekil 2A'da, NS2B-NS3 proteazının aktivitesini belirlemek için kullanılan testin şematik bir gösterimini görüyoruz. Şekil 2B'de, NS2B-NS3 proteazını hedefleyen belirli bir inhibitörün doz-yanıt eğrisini görüyoruz.
Şekil 2C'de, NS5 RdRp etkinliğini belirlemek için kullanılan uzama testinin şematik bir gösterimini görüyoruz. Şekil 2D'de, Zika virüsü RdRp aktivitesini hedefleyen belirli bir inhibitörün doz-yanıt grubunu görüyoruz. Gösterilen prosedürler, 384 veya 1, 536 kuyu formatlarındaki taramalar için kolayca uyarlanabilir.
Replikon bazlı yüksek verimli taramalar için, 5'uçta bir Renilla luciferaz dizisi içeren çoğaltıcı bir Zika virüsü replikononu ve ayrıca 3'lü uçta bir iç ribozomal giriş bölgesi tarafından yönlendirilen bir neomisin fosfotransferaz geni içeren kararlı bir hücre hattı geliştirdik. Yapısal genlerin eksikliği nedeniyle, replikonlar soy virionları üretmez. Böylece, laboratuvar edinilmiş viral enfeksiyon riskini ortadan kaldırır.
Ayrıca rekombinant NS3 proteaz ve NS5 RdRp için viral enzim bazlı tahlillerde kullanılan prosedürleri de gösterdik. Viral proteazın proteolitik aktivitesi, Floresan stok aminometilcoumarin ile birleştiğinde Zika virüsü proteaz tanıma ve bölünme dizilerini içeren florojenik peptit substrat kullanılarak ölçüldü. NS5 RNA'ya bağımlı RNA polimeraz ile ilgili olarak, uzama aktivitesi SYBR Green I.'ın floresan sinyalinin artmasıyla doğrudan tespit edilir.Bu uygulama, doğrudan ölçüm ve uygun fiyatlılık, kullanıcının floresan tabanlı yöntemlerinin yüksek verimli tarama platformları olarak önemli noktalarıdır.
