L’objectif global de ces procédures est de dépister les inhibiteurs de la réplication du virus Zika dans un format de dépistage à haut débit, à l’aide d’un test à base de réplicon et/ ou d’un dosage à base d’enzymes virales. La découverte de médicaments antiviraux nécessite le développement de tests cellulaires et biochimiques fiables qui peuvent être effectués dans des formats de criblage à haut débit. Les dépistages à base de réplicon et les tests à base d’enzymes virales sont deux stratégies précieuses pour tester les composés de petites molécules en tant qu’inhibiteurs du virus Zika.
Les replicons sont des systèmes sous-économiques auto-réplicants exprimés dans des cellules de mammifères dans lesquels les gènes structurels viraux sont remplacés par un gène rapporteur. Dans notre laboratoire, nous avons développé un système de réplicon du virus Zika, y compris la renilla luciferase, qui est exprimée de manière stable dans les lignées cellulaires BHK-21 de bébé hamster. Les effets inhibiteurs des composés sur la réplication de l’ARN viral peuvent être facilement évalués en mesurant la réduction de l’activité de la luciférase.
Pour caractériser les cibles spécifiques des composés identifiés, nous avons établi des tests in vitro basés sur la fluorescence pour la protéase NS3 exprimée par recombinaison et l’ARN polymérase dépendante de l’ARN NS5, le RdRp. Commencez par cultiver des cellules de réplication virale Zika jusqu’à ce qu’elles atteignent 70 à 90% de confluence. Dans un flux laminaire stérile, retirer et jeter le support de la fiole.
Ajouter cinq mils de trypsine-EDTA à la fiole. Étaler la solution de trypsine sur les cellules et laisser la fiole pendant cinq à 10 minutes pour que les cellules se détachent. Récoltez les cellules ressuspendées et placez-les dans le tube stérile de 50 mil et centrifugez-les pendant 125G pendant cinq minutes.
Après avoir éliminé le surnageant, ressuspendez les cellules en cinq mils de DMEM 10% FBS pour le comptage. Ajustez les cellules à deux fois 10 à quatre par puits et ensemencez-les dans une plaque de 96 puits. Ensuite, incubez la plaque pendant 16 heures à 37 degrés Celsius dans un incubateur d’humidificateur à CO2.
Ensuite, jetez le milieu et ajoutez 100 microlitres par puits de DMEM 2% FBS. Ajouter un microlitre du composé par puits pour donner une concentration finale de 10 micromolaires et de 1 % de DMSO dans le milieu d’essai. Dans la première et la dernière colonne, préparez le contrôle positif et négatif.
Incuber la plaque pendant 48 heures à 37 degrés Celsius dans un incubateur d’humidificateur à CO2. Préparer le tampon de lyse renilla luciferase dans un réactif conformément aux instructions de fabrication. Après avoir éliminé le surnageant des cellules, ajoutez 25 microlitres de tampon de lyse renilla luciferase par puits.
Ajouter 100 microlitres de réactif de dosage de la renilla luciférase par puits à une plaque blanche opaque de 96 puits. Transférez 20 microlitres du lysate cellulaire sur la plaque blanche, puis lisez les signaux de luminescence dans le luminomètre. Pour le test MTT, la procédure a déjà démontré et après incubation de composé, ajouter 10 microlitres par puits de solution MTT aux cellules et incuber la plaque à 37 degrés Celsius dans un humidificateur de CO2 pendant 24 heures.
Jetez le surnageant et ajoutez 100 microlitres de DMSO à chaque puits, puis solubilisez les cristaux de formazan en pipetant de haut en bas. Lisez les absorbants à 570 nanomètres dans un spectrophotomètre. Après avoir décongelé les matériaux sur la glace, préparez une quantité appropriée de dilution protéique pour atteindre une concentration finale de quatre nanomolaires par puits.
Dans une plaque blanche de 96 puits, distribuer 84 microlitres du tampon d’essai dans chaque puits. Pour préparer une réaction de contrôle, ajoutez un microlitre de DMSO à la première colonne de la plaque. Ajouter un microlitre des composés testés pour atteindre une concentration finale de 10 micromolaires à la plaque.
Distribuer cinq microlitres par puits de solution de protéase, à l’exclusion des témoins, et incuber la plaque à quatre degrés Celsius pendant 30 minutes. Pour commencer la réaction, distribuer 10 microlitres de solution de substrat fluorogénique aux puits. Suivez leur réaction à l’aide d’un fluoromètre réglé dans les paramètres appropriés.
Pour cette séance, tous les réactifs doivent être préparés avec de l’eau traitée au DEPC. Recuit l’ARN polyuridine en l’incubant à 55 degrés Celsius pendant cinq minutes dans un cycleur thermique. Décongeler les matériaux sur la glace et diluer la protéine pour atteindre une concentration finale de 250 nanomolaires dans le tampon d’essai.
Préparez le tampon de dosage de la solution SYBR Green I, puis ajoutez l’ATP et l’ARN anéalé à une concentration finale d’un millimolaire et de 300 nanomolaires, respectivement. Dans une plaque de PCR, ajouter 24,5 microlitres de la protéine diluée dans les colonnes un à 11. Ajouter le même volume de tampon d’essai dans les puits restants.
Ajouter 0,5 microlitre par puits de composés et de témoins pour atteindre une concentration finale de 10 micromolaires. Après 15 minutes d’incubation, commencez la réaction en ajoutant 25 microlitres de la solution de substrat et scellez la plaque. Suivez la réaction dans un système de PCR en temps réel incubé à 30 degrés Celsius à l’aide d’un filtre FAM.
Dans la figure 1A, nous voyons une représentation schématique de la construction de l’ARN développée pour obtenir des lignées cellulaires de réplication virale Zika, montrant que le gène Rluc remplace les séquences structurelles et la nouvelle cassette IRES insérée à l’extrémité 3'. Il comprend également un promoteur T7 dans la séquence ribozyme du virus de l’hépatite delta pour la transcription in vitro et pour la génération de l’extrémité 3'authentique et du transcrit ARN, respectivement. Dans la figure 1B, nous voyons une représentation schématique du test de cellule basé sur la réplicône.
Dans la figure 1C, nous voyons les courbes dose-réponse et les courbes de cytotoxicité d’un composé donné obtenu à l’aide du système de réplicon de Rluc. Dans la figure 2A, nous voyons une représentation schématique du dosage utilisé pour déterminer l’activité de la protéase NS2B-NS3. Dans la figure 2B, nous voyons la courbe dose-réponse d’un inhibiteur donné ciblant la protéase NS2B-NS3.
Dans la figure 2C, nous voyons une représentation schématique du test d’allongement utilisé pour déterminer l’activité NS5 RdRp. Dans la figure 2D, nous voyons le groupe dose-réponse d’un inhibiteur donné ciblant l’activité RdRp du virus Zika. Les procédures démontrées pourraient être facilement adaptées pour les dépistages dans des formats 384 ou 1 536 puits.
Pour les dépistages à haut débit basés sur la réplicon, nous avons développé une lignée cellulaire stable abrinant une réplication du virus Zika contenant une séquence de renilla luciférase à l’extrémité 5', ainsi qu’un gène de néomycine phosphotransférase piloté par un site d’entrée ribosomique interne à l’extrémité 3'. En raison du manque de gènes structurels, les replicons ne produisent pas de virions de descendance. Ainsi, éliminer le risque d’infection virale acquise en laboratoire.
En outre, nous avons également démontré les procédures utilisées dans les tests à base d’enzymes virales pour la protéase recombinante NS3 et NS5 RdRp. L’activité protéolytique de la protéase virale a été mesurée à l’aide d’un substrat peptidique fluorogénique, qui contient les séquences de reconnaissance et de clivage de la protéase du virus Zika couplées à l’aminométhylcycoumarine de fluorescence. En ce qui concerne l’ARN polymérase dépendante de l’ARN NS5, son activité d’allongement est directement détectée par l’augmentation du signal fluorescent de SYBR Green I.Ces implémentations, mesures directes et abordabilité sont des points clés des méthodes basées sur la florescence de l’utilisateur en tant que plates-formes de criblage à haut débit.
