El objetivo general de estos procedimientos es detectar inhibidores de la replicación del virus del Zika en un formato de detección de alto rendimiento, utilizando un ensayo basado en replicon y / o en enzimas virales. El descubrimiento de fármacos antivirales requiere el desarrollo de ensayos celulares y bioquímicos confiables que se puedan realizar en formatos de detección de alto rendimiento. Los exámenes basados en replicon y los ensayos basados en enzimas virales son dos estrategias valiosas para probar compuestos de moléculas pequeñas como inhibidores del virus del Zika.
Los replicones son sistemas subgenómicos autorreplicantes expresados en células de mamíferos en los que los genes estructurales virales son reemplazados por un gen reportero. En nuestro laboratorio, desarrollamos un sistema de replicon del virus del Zika, incluida la renilla luciferasa, que se expresa de manera estable en las líneas celulares BHK-21 del hámster bebé. Los efectos inhibitorios de los compuestos sobre la replicación del ARN viral se pueden evaluar fácilmente midiendo la reducción de la actividad de la luciferasa.
Para caracterizar los objetivos específicos de los compuestos identificados, establecimos ensayos in vitro basados en fluorescencia para la proteasa NS3 expresada recombinantemente y la ARN polimerasa dependiente del ARN NS5, la RdRp. Comience cultivando las células del replicon viral del Zika hasta que alcancen una confluencia del 70 al 90 por ciento. En un flujo laminar estéril, retire y deseche el medio del matraz.
Agregue cinco milésimas de tripsina-EDTA al matraz. Extienda la solución de tripsina sobre las células y deje el matraz durante cinco a 10 minutos para que las células se desprendan. Cosechar las células resuspendidas y colocarlas en el tubo estéril de 50 mil y centrifugarlas por 125G durante cinco minutos.
Después de desechar el sobrenadante, resuspend las células en cinco mils de DMEM 10% FBS para contar. Ajuste las células a dos veces 10 a cuatro por pozo y sembrarlas en una placa de 96 pozos. Luego incuba la placa durante 16 horas a 37 grados centígrados en una incubadora humidificadora de CO2.
A continuación, deseche el medio y agregue 100 microlitros por pozo de DMEM 2% FBS. Agregue un microlitro del compuesto por pozo para obtener una concentración final de 10 micromolares y 1% DMSO en el medio de ensayo. En la primera y en la última columna, prepare el control positivo y negativo.
Incubar la placa durante 48 horas a 37 grados centígrados en una incubadora humidificadora de CO2. Prepare el tampón de lisis de Renilla luciferasa en reactivo de acuerdo con las instrucciones de fabricación. Después de desechar el sobrenadante de las células, agregue 25 microlitros de tampón de lisia renilla luciferasa por pozo.
Agregue 100 microlitros de reactivo de ensayo de renilla luciferasa por pozo a una placa blanca opaca de 96 pozos. Transfiera 20 microlitros del lisado celular a la placa blanca y luego lea las señales de luminiscencia en el luminómetro. Para el ensayo MTT, el procedimiento se ha demostrado previamente y después de la incubación del compuesto agregar 10 microlitros por podo de solución MTT a las células e incubar la placa a 37 grados centígrados en un humidificador de CO2 durante 24 horas.
Deseche el sobrenadante y agregue 100 microlitros de DMSO a cada pozo, y luego solubilice los cristales de formazano mediante el pipeteo hacia arriba y hacia abajo. Lea los absorbentes a 570 nanómetros en un espectrofotómetro. Después de descongelar los materiales en hielo, prepare una cantidad adecuada de dilución de proteínas para alcanzar una concentración final de cuatro nanomolares por pozo.
En una placa blanca de 96 pozos, dispense 84 microlitros del tampón de ensayo en cada pozo. Para preparar una reacción de control, agregue un microlitro de DMSO a la primera columna de la placa. Agregue un microlitro de los compuestos probados para alcanzar una concentración final de 10 micromolares a la placa.
Dispensar cinco microlitros por pozo de solución de proteasa, excluyendo los controles e incubar la placa a cuatro grados centígrados durante 30 minutos. Para iniciar la reacción, dispense 10 microlitros de solución de caldo de sustrato fluorogénico a los pozos. Siga su reacción utilizando un fluorómetro establecido en los parámetros apropiados.
Para esta sesión, todos los reactivos deben prepararse con agua tratada con DEPC. Anneal el ARN de poliuridina incubándolo a 55 grados centígrados durante cinco minutos en un termociclador. Descongele los materiales en hielo y diluya la proteína para alcanzar una concentración final de 250 nanomolares en el tampón del ensayo.
Prepare el tampón de ensayo de solución SYBR Green I y luego agregue ATP y el ARN anealed a una concentración final de un milimolar y 300 nanomolares, respectivamente. En una placa de PCR, agregue 24.5 microlitros de la proteína diluida en las columnas uno a 11. Agregue el mismo volumen del búfer de ensayo en los pozos restantes.
Añadir 0,5 microlitros por pozo de compuestos y controles para alcanzar una concentración final de 10 micromolares. Después de 15 minutos de incubación, comience la reacción agregando 25 microlitros de la solución de sustrato y selle la placa. Siga la reacción en un sistema de PCR en tiempo real incubado a 30 grados centígrados utilizando un filtro FAM.
En la figura 1A, vemos una representación esquemática del constructo de ARN desarrollado para obtener líneas celulares de replicon viral del Zika, mostrando que el gen Rluc reemplaza las secuencias estructurales y el nuevo cassette IRES insertado en el extremo 3'. También incluye un promotor T7 en la secuencia de ribozimas del virus de la hepatitis delta para la transcripción in vitro y para la generación de la transcripción auténtica de 3'end y arn, respectivamente. En la figura 1B, vemos una representación esquemática del ensayo celular basado en replicon.
En la figura 1C, vemos las curvas dosis-respuesta y las curvas de citotoxicidad de un compuesto dado obtenidas utilizando el sistema de replicon de Rluc. En la figura 2A, vemos una representación esquemática del ensayo utilizado para determinar la actividad de la proteasa NS2B-NS3. En la figura 2B, vemos la curva dosis-respuesta de un inhibidor dado dirigido a la proteasa NS2B-NS3.
En la figura 2C, vemos una representación esquemática del ensayo de elongación utilizado para determinar la actividad NS5 RdRp. En la figura 2D, vemos el grupo dosis-respuesta de un inhibidor dado dirigido a la actividad RdRp del virus Zika. Los procedimientos demostrados podrían adaptarse fácilmente para las pruebas de detección en formatos de 384 o 1, 536 pozos.
Para los exámenes de alto rendimiento basados en replicon, desarrollamos una línea celular estable que alberga un replicon replicativo del virus Zika que contiene una secuencia de Renilla luciferasa en el extremo 5', y también un gen de la fosfotransferasa de neomicina impulsado por un sitio de entrada ribosómico interno en el extremo 3'. Debido a la falta de genes estructurales, los replicones no producen viriones de progenie. Por lo tanto, eliminando el riesgo de infección viral adquirida en laboratorio.
Además, también demostramos los procedimientos utilizados en los ensayos basados en enzimas virales para la proteasa NS3 recombinante y NS5 RdRp. La actividad proteolítica de la proteasa viral se midió mediante el uso de un sustrato peptídico fluorogénico, que contiene el reconocimiento de la proteasa del virus del Zika y secuencias de escisión junto con la cepa de fluorescencia aminometilcumarina. Con respecto a la ARN polimerasa dependiente de ARN NS5, su actividad de elongación se detecta directamente por el aumento de la señal fluorescente de SYBR Green I.Esta implementación, medición directa y asequibilidad son puntos clave para los métodos basados en florescencia del usuario como plataformas de detección de alto rendimiento.
