الهدف العام لهذا الإجراء هو متابعة تشكيل البروبليت في الوقت الحقيقي من الخلايا العملاقة الماوس ، والتي نضجت في بيئتها الأصلية. هذه الطريقة لديها ميزة كونها بسيطة، استنساخها، وبسرعة. يمكن للمرء أن يحلل العديد من الخلايا الضخمة وتصور تشكيل الصفائح في ست ساعات فقط ، بدلا من الانتظار لليوم الأول من الثقافة كما هو الحال بالنسبة لخلايا الماوس الضخمة في المختبر.
تطبيق مثير للاهتمام من هذه الطريقة هو إمكانية لدراسة تأثير العلاج الصيدلاني أو الطفرة الوراثية، وتحديدا في خطوة تمديد البربليتليت. وهنا لا يوجد أي تدخل في عملية التمايز، كما هو الحال في الثقافة داخل المختبر. يساعد هذا الفيديو على ضمان هذه الخطوات الرئيسية لمسح وقطع نخاع العظم.
كما أنه يشرح كيفية تصنيف مورفولوجيا وmegakaryocytes ، وهو أمر مفيد حقا لوصف العيوب في مرض الجلطات الدموية. للبدء، دافئة العازلة التيرود في 37 درجة مئوية، وبدوره على غرفة التدفئة من المجهر لجعل درجة الحرارة إلى 37 درجة مئوية. إعداد جميع الأدوات اللازمة، مثل جهاز توقيت، غرف الحضانة، وخمسة محاقن قياس 21 ملليلتر، ملقط، شفرة حلاقة، ماصة باستور، الشرائح الزجاجية، وأنبوب الطرد المركزي 15 ملليلتر.
قم بغسل نخاع العظم بميليلترين من العازلة في Tyrode عن طريق إدخال إبرة قياس 21 في فتحة عظم الفخذ على جانب الركبة ، واضغط ببطء على المكبس لاسترداد أسطوانة نخاع سليمة. استخدام ماصة بلاستيكية لمدة ثلاث دقائق لتر لنقل بعناية وبلطف نخاع العظام سليمة على شريحة زجاجية. قطع نهايات النخاع التي قد تكون مضغوطة في وقت تدفق.
ثم قطع أجزاء عرضية رقيقة من سمك 0.5 ملليمتر باستخدام شفرة حلاقة حادة لتجنب إتلاف megakaryocytes. باستخدام ماصة بلاستيكية، اجمع 10 أقسام في أنبوب ملليلتر واحد يحتوي على المخزن المؤقت لتيرود. نقل بعناية أقسام إلى غرفة حضانة بقطر 13 ملليمتر.
يستنشق العازلة وضبط حجم إلى 30 ميكرولتر من العازلة التيرود تكملها مع مصل الماوس 5٪. ضع المقاطع على مسافة. ختم غرفة لاصقة الذاتي مع زلة غطاء 22 في 55 ملليمتر، يميل زلة الغطاء لتجنب تشكيل فقاعات الهواء.
ضع الغرفة في غرفة التدفئة عند 37 درجة مئوية. بدء الكرونومتر وتشغيل التجربة لمدة ست ساعات في 37 درجة مئوية، وجعل أشرطة الفيديو لتسجيل التحول من megakaryocytes. بعد 30 دقيقة، تهاجر خلايا النخاع تدريجيا إلى محيط الزرع الذي يشكل طبقة أحادية.
بعد ساعة واحدة من الحضانة ، يمكن التعرف على الخلايا الضخمة من خلال حجمها الكبير والنوى متعددة الأضلاع. يزداد عدد الخلايا العملاقة بعد ثلاث ساعات من الحضانة ، وبعضها له امتدادات طويلة. رسم خريطة لتعريب كل قسم في غرفة الحضانة.
بعد ساعة واحدة، حدد الخلايا الضخمة المرئية، وهي خلايا عملاقة متعددة الأضلاع على أطراف كل قسم، ورسم مواقعها على الرسم. كرر هذا الإجراء بعد ثلاث وست ساعات. يتم حساب الخلايا الضخمة يدويا وتصنيفها وفقا لمورفولوجيا في ثلاث وست ساعات بعد ختم غرفة الحضانة.
يتم تصنيفها على أنها صغيرة وكبيرة مع نية سميكة ، وتمتد بروبليت. بمساعدة رسم الخرائط ، يمكن متابعة تطورها مع مرور الوقت. يتم التعبير عن النتائج كنسبة مئوية من كل فئة في كل وقت مراقبة.
كلاسيكيا، نصف الخلايا الضخمة المرئية في المحيط تمتد الصفائح في ست ساعات لنخاع عظم الفأر البرية نوع. وأعقب مصير megakaryocytes جولة من خلال التقاط الصور المتتابعة مع مرور الوقت لتصوير كيف أنها تشكل proplatelets. شيء مهم أن نتذكر عند محاولة هذا الإجراء هو الحفاظ على explants في 37 درجة مئوية لمدة التجربة.
يمكن لدرجة حرارة مختلفة تغيير النتائج. ومن المثير للاهتمام، يمكن استخدام بروتوكول الزرع بعد تجارب المجهر الانطوائية. في النهاية سوف تكون الخلايا الضخمة في explants نخاع العظم الفلورسنت بشكل طبيعي، وسلوكهم يمكن التحقيق بسهولة.
وهذا يجعل من الممكن الجمع بين معاملة مختلفة على نفس الحيوانات وبالتالي تقليل عدد الفئران. في الختام ، فإن طريقة الاختلاط سريعة وبسيطة ، وتوفر العديد من المعلومات حول قدرة الخلايا العملاقة الطبيعية على الصفائح الخارجية. النتيجة النوعية والكمية الناتجة هي المفتاح لفهمنا لمرض الجلطات الدموية.
في سياق فسيولوجي أو مرضي.
