המטרה הכוללת של הליך זה היא לעקוב בזמן אמת אחר היווצרות של proplatelet מן megakaryocytes עכבר, אשר התבגר בסביבתם הטבעית. לשיטה זו יש את היתרון בלהיות פשוטה, ניתנת לשחזור ומהירה. אפשר לנתח מגה-קריוציטים רבים ולדמיין את היווצרות הנפצים בשש שעות בלבד, במקום לחכות ליום הראשון של התרבות באשר למגקריוציטים של עכבר במבחנה.
יישום מעניין של שיטה זו היא אפשרות לחקור את ההשפעה של הטיפול התרופתי או מוטציה גנטית, במיוחד בשלב של הרחבת proplatelet. כאן אין הפרעה לתהליך הבידול, כמו במקרה של תרבות אין ויטרו. וידאו זה מסייע להבטיח את השלבים העיקריים הבאים של שטיפה וחיתוך מח העצם.
זה גם מוסבר כיצד לסווג את המורפולוגיה ואת megakaryocytes, וזה באמת שימושי לאפיון של פגמים במחלה תרומבופילית. ראשית, לחמם את המאגר של טיירוד ב 37 מעלות צלזיוס, ולהדליק את תא החימום של המיקרוסקופ כדי להביא את הטמפרטורה ל 37 מעלות צלזיוס. הכן את כל הכלים הדרושים, כגון טיימר, תאי דגירה, חמישה מיליליטר 21 מזרקים מד, מלקחיים, סכין גילוח, פיפטות פסטר, מגלשות זכוכית, וצינור צנטריפוגה 15 מיליליטר.
לשטוף את מח העצם עם שני מיליליטר של המאגר של טיירוד על ידי החדרת מחט 21 מד לתוך הפתח של עצם הירך בצד הברך, ולאט לאט לחץ על הבוכנה כדי לאחזר גליל מח שלם. השתמש פיפטה פלסטיק של שלוש דקות כדי להעביר בזהירות ובעדינות את מח העצם שלם על מגלשת זכוכית. חותכים את קצות מח העצם שאולי נדחסו בזמן השטיפה.
לאחר מכן לחתוך קטעים רוחביים דקים של עובי 0.5 מילימטר באמצעות סכין גילוח חד כדי למנוע פגיעה megakaryocytes. באמצעות פיפטה מפלסטיק, לאסוף 10 חלקים לתוך צינור מיליליטר אחד המכיל את המאגר של טיירוד. מעבירים בזהירות את המקטעים לתא דגירה בקוטר של 13 מ"מ.
שאפו את המאגר והתאמו את עוצמת הקול ל-30 מיקרוליטרים של המאגר של טיירוד בתוספת סרום עכבר של 5%. מקם את המקטעים במרחק. לאטום את תא הדבק העצמי עם 22 על 55 מילימטר כיסוי להחליק, נטייה להחליק הכיסוי כדי למנוע היווצרות של בועות אוויר.
מניחים את התא בתא החימום ב 37 מעלות צלזיוס. התחל את הכרונומטר והפעל את הניסוי במשך שש שעות ב 37 מעלות צלזיוס, הפוך קטעי וידאו כדי להקליט את הטרנספורמציה של megakaryocytes. לאחר 30 דקות, תאי מח העצם נודדים בהדרגה לפריפריה של explant ויוצרים שכבת מונו.
לאחר שעה אחת של דגירה, megakaryocytes ניתן לזהות על ידי גודלם הגדול גרעינים polylobulated. מספר המגקריוציטים גדל לאחר שלוש שעות של דגירה, ולחלקם יש הארכות ארוכות. צייר מפה כדי להתאים כל מקטע בתא הדגירה.
לאחר שעה, זהה את המגקריוציטים הנראים לעין, שהם תאים פולילוביבוליים ענקיים בפריפריה של כל קטע, ושרטט את מיקומם על הציור. חזור על הליך זה לאחר שלוש ושש שעות. מגהקריוציטים נספרים באופן ידני ומסווגים לפי המורפולוגיה שלהם בשלוש ושש שעות לאחר איטום תא הדגירה.
הם מסווגים כקטנים, גדולים עם כוונה עבה, והרחבת פרופלטציה. בעזרת מיפוי, ניתן לעקוב אחר התפתחותם לאורך זמן. התוצאות מתבטאות כאחוז מכל כיתה בכל זמן תצפית.
באופן קלאסי, מחצית המגקריוציטים הנראים בפריפריה מרחיבים את הנפצים בשש שעות עבור מח עצם עכבר מסוג בר. גורלם של מגה-קריוציטים עגולים לוותה בלכידת תמונות רצפיות לאורך זמן כדי לדמיין כיצד הם יוצרים מפיץ. דבר חשוב לזכור בעת ניסיון הליך זה הוא לשמור על explants ב 37 מעלות צלזיוס למשך הניסוי.
טמפרטורה שונה יכולה לשנות את התוצאות. מעניין, פרוטוקול explant ניתן להשתמש לאחר ניסויי מיקרוסקופיה מופנם. בסופו של דבר המגקריוציטים במח העצם יהיו פלואורסצנטיים באופן טבעי, וניתן לחקור את התנהגותם בקלות.
זה מאפשר לשלב טיפול שונה על אותם בעלי חיים ובכך להפחית את מספר העכברים. לסיכום, שיטת ההסברה מהירה, פשוטה ומספקת מידע רב על יכולתם של מגה-קריוציטים טבעיים לתפוחים חיצוניים. הממצא האיכותי והכמותי המתקבל הם המפתח להבנתנו את המחלה הטרובופילית.
בהקשר פיזיולוגי או פתולוגי.
