Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens ist es, in Echtzeit die Bildung von Proplatelett aus Megakaryozyten der Maus zu verfolgen, die in ihrer natürlichen Umgebung gereift sind. Diese Methode hat den Vorteil, dass sie einfach, reproduzierbar und schnell ist. Man kann viele Megakaryozyten analysieren und die Bildung von Proplaten in nur sechs Stunden visualisieren, anstatt auf den ersten Tag der Kultur zu warten, wie bei Maus-Megakaryozyten in vitro.
Eine interessante Anwendung dieser Methode ist die Möglichkeit, die Wirkung der pharmazeutischen Behandlung oder genetischen Mutation zu untersuchen, insbesondere im Schritt der Proplatatadierung. Hier gibt es keinen Eingriff in den Differenzierungsprozess, wie im Fall der In-vitro-Kultur. Dieses Video hilft, diese wichtigen Schritte des Spülens und Schneidens des Knochenmarks sicherzustellen.
Es wird auch erklärt, wie man die Morphologie und Megakaryozyten klassifiziert, was für die Charakterisierung von Defekten bei thrombophilen Erkrankungen wirklich nützlich ist. Erwärmen Sie zunächst Tyrodes Puffer auf 37 Grad Celsius und schalten Sie die Heizkammer des Mikroskops ein, um die Temperatur auf 37 Grad Celsius zu bringen. Bereiten Sie alle notwendigen Werkzeuge wie einen Timer, Inkubationskammern, fünf Milliliter 21 Gauge Spritzen, Pinzette, eine Rasierklinge, Pasteur pipetten, Glasobjektträger und 15 Milliliter Zentrifugenröhrchen vor.
Spülen Sie das Knochenmark mit zwei Millilitern Tyrodes Puffer, indem Sie eine 21-Gauge-Nadel in die Öffnung des Femurs auf der Knieseite einführen, und drücken Sie langsam auf den Kolben, um einen intakten Markzylinder zu entnehmen. Verwenden Sie eine Drei-Minuten-Liter-Kunststoffpipette, um das intakte Knochenmark vorsichtig und vorsichtig auf einen Glasträger zu übertragen. Schneiden Sie die Enden des Knochenmarks ab, die zum Zeitpunkt der Spülung möglicherweise komprimiert wurden.
Schneiden Sie dann dünne Querschnitte von 0,5 Millimeter Dicke mit einer scharfen Rasierklinge, um eine Beschädigung der Megakaryozyten zu vermeiden. Sammeln Sie mit einer Kunststoffpipette 10 Abschnitte in einem Ein-Milliliter-Röhrchen, das Tyrodes Puffer enthält. Die Abschnitte werden vorsichtig in eine Inkubationskammer mit einem Durchmesser von 13 Millimetern überführt.
Saugen Sie den Puffer ab und stellen Sie das Volumen auf 30 Mikroliter tyrodes Puffer ein, der mit 5% Mausserum ergänzt wird. Positionieren Sie die Abschnitte in einiger Entfernung. Versiegeln Sie die selbstklebende Kammer mit einem 22 x 55 Millimeter großen Abdeckschlupf und neigen Sie den Abdeckschlitten an, um die Bildung von Luftblasen zu vermeiden.
Stellen Sie die Kammer bei 37 Grad Celsius in die Heizkammer. Starten Sie den Chronometer und führen Sie das Experiment sechs Stunden lang bei 37 Grad Celsius durch, Machen Sie Videos, um die Transformation der Megakaryozyten aufzuzeichnen. Nach 30 Minuten wandern die Markzellen allmählich an die Peripherie der Explantation und bilden eine Monoschicht.
Nach einer Stunde Inkubation können Megakaryozyten anhand ihrer größe und polylobulierten Kerne identifiziert werden. Die Anzahl der Megakaryozyten nimmt nach drei Stunden Inkubation zu, und einige haben lange Verlängerungen. Zeichnen Sie eine Karte, um jeden Abschnitt in der Inkubationskammer zu lokalisieren.
Identifizieren Sie nach einer Stunde die sichtbaren Megakaryozyten, bei denen es sich um riesige polylobulierte Zellen an der Peripherie jedes Abschnitts handelt, und zeichnen Sie ihre Positionen auf der Zeichnung auf. Wiederholen Sie diesen Vorgang nach drei und sechs Stunden. Megakaryozyten werden manuell gezählt und drei und sechs Stunden nach dem Versiegeln der Inkubationskammer nach ihrer Morphologie klassifiziert.
Sie werden als klein, groß mit dicker Absicht und Proplatlet-Erweiterung klassifiziert. Mit Hilfe der Kartierung kann ihre Entwicklung im Laufe der Zeit verfolgt werden. Die Ergebnisse werden als Prozentsatz jeder Klasse zu jedem Beobachtungszeitpunkt ausgedrückt.
Klassischerweise erstreckt sich die Hälfte der an der Peripherie sichtbaren Megakaryozyten nach sechs Stunden für das Knochenmark der Wildtyp-Maus. Dem Schicksal der runden Megakaryozyten folgte die Aufnahme sequenzieller Bilder im Laufe der Zeit, um abzubilden, wie sie Proplatelette bilden. Eine wichtige Sache, an die Sie sich erinnern sollten, wenn Sie dieses Verfahren versuchen, ist, die Explantate für die Dauer des Experiments bei 37 Grad Celsius zu halten.
Eine andere Temperatur kann die Ergebnisse verändern. Interessanterweise kann das Explantatprotokoll nach introvertierten Mikroskopieexperimenten verwendet werden. Am Ende werden die Megakaryozyten in den Explantraten des Knochenmarks von Natur aus fluoreszierend sein, und ihr Verhalten kann leicht untersucht werden.
Dies ermöglicht es, verschiedene Behandlungen an denselben Tieren zu kombinieren und so die Anzahl der Mäuse zu reduzieren. Zusammenfassend lässt sich sagen, dass die Explantatmethode schnell und einfach ist und viele Informationen über die Kapazität natürlicher Megakaryozyten zu externen Proplaten liefert. Die daraus resultierenden qualitativen und quantitativen Befunde sind der Schlüssel zu unserem Verständnis thrombophiler Erkrankungen.
in einem physiologischen oder pathologischen Kontext.
