قد تساعد هذه المقايسات على توضيح دور بقايا التربتوفان في البروتينات عند إجراء دراسات ربط ANS. وفلورة ANS يزيد على ملزمة لمواقع هيكلية محددة في البروتينات. في بعض الأحيان ANS موقع ملزم يحدد موقع قريب من بقايا التربتوفان مع المسافة التي تشير إلى وجود FRET بين التربتوفان و ANS.
NBS يتوسط التعديل الكيميائي لمخلفات التربتوفان في البروتينات, إخماد مضان لها. ولذلك, هذه المقايسات تسمح بتحديد ما إذا كانت بقايا التربتوفان تسهم في زيادة كثافة مضان ANS من قبل FRET. في هذا العمل، نستخدم مجال ربط النيوكليوتيدات المؤتلف المهندس من SERCA الذي يحتوي على طفرات، بهدف تحديد موقع التربتوفان بالقرب من موقع ربط النيوكليوتيدات حيث يربط ANS أيضا.
هذا المقايسة سريعة وسهلة الأداء ، وبالتالي ميزتها الرئيسية. التصميم في سيليكو من ANS وSERCA N-المجال التفاعل. توليد بنية ثلاثية الأبعاد من البروتين عن طريق النمذجة الجزيئية باستخدام برنامج نمذجة البروتين المفضل.
تحديد بقايا الأحماض الأمينية التي تشكل موقع الربط النيوكليوتيدات باستخدام البرامج الهيكلية الجزيئية المفضلة وتحديد وجود بقايا أرجينين والليسين. هذه مطلوبة لربط ANS وزيادة كثافة الفلورسينس. بسبب وجود بقايا أرجينين والليسين في موقع الربط النيوكليوتيدات من SERCA، ونحن نفترض ربط ANS إلى N-المجال.
في النموذج ثلاثي الأبعاد ، يتم تحديد بقايا الأحماض الأمينية التي تشكل موقع ربط ATP وتسليط الضوء عليها باللون البرتقالي. وبالمثل، يقع طفرة التيروزين إلى التربتوفان وتسليط الضوء باللون الأزرق. إجراء الالتحام الجزيئي مع ATP و FITC و ANS.
تظهر نتائج الإرساء أن ANS يناسب بشكل جيد في موقع ربط النيوكليوتيدات ، على غرار ATP و FITC. FITC التسميات موقع الربط النيوكليوتيدات. حساب المسافة الجزيئية بين بقايا التربتوفان و ANS.
20 angstroms ويبدو أن المسافة المناسبة ل FRET. إجراء محاكاة ديناميكية جزيئية لمجمع ANS N-Domain لتحديد استقرار التفاعل. يظهر وقت محاكاة 10 نانو ثانية استقرار المجمع.
المضي قدما لإجراء التجارب في المختبر. التعبير وتنقية من N-المجال المؤتلف. التعبير والتنقية، من خلال الكروماتوغرافيا تقارب، والمهندسة المؤتلف N-المجال.
إجراء SDS-PAGE من البروتين المنقى لتحديد النقاء. تحديد تركيز البروتين عن طريق الامتصاص عند الطول الموجي من 280 نانومتر مع معامل انقراض N-Domain. رصد تشكيل مجمع ANS N-Domain استنادا إلى التغيرات في كثافة الإضاءة ANS وN-Domain.
إعداد حل الأسهم ANS في N، N-Dimethylformamide. تزن كمية صغيرة من ANS، بين 1-5 ملليغرام. حل ANS في مل واحد من الحجم النهائي من N، N-Dimethylformamide.
إعداد 100 ميكرومولار ANS الأسهم الحل باستخدام حل ANS في N، N-Dimethylformamide. خلط الحل عن طريق دوامة ثلاث إلى خمس مرات. إعداد NBS الأسهم الحل في N، N-Dimethylformamide.
وزن كمية صغيرة من NBS، واحد إلى خمسة ملليغرام. حل NBS في مل واحد من N، N-ديميثيلفورماميد. إعداد حل سهم NBS ميليمولار واحد باستخدام حل NBS في N، N-Dimethylformamide.
خلط الحل عن طريق دوامة ثلاث إلى خمس مرات. ي titrate N-المجال مع ANS وتسجيل أطياف مضان للإثارة في الطول الموجي من 295 نانومتر في 25 درجة. الحصول على خط الأساس الطيف الفلوري.
ضع مل واحد من 50 ميليمولار الفوسفات العازلة مع الحموضة ثمانية في واحد مل الكوارتز الفلوري cuvette. ضع الخلية في غرفة الخلية الحرارية للمطياف وحدد الطول الموجي للإثارة إلى 295 نانومتر. سجل طيف الفلورسينس.
يظهر طيف الفلورسينس الفراغي ذروة الماء، والتي يجب طرحها لاحقا. الحصول على الطيف الفلوري الجوهري للمجال N. ضع 900 ميكرولتر من 50 ملليمولار من الفوسفات العازلة مع pH 8 في كوفيت كوفيت كوارتز مضان.
إضافة 100 ميكرولتر من تعليق N-المجال لتسفر عن تركيز واحد N-المجال ميكرومولار النهائي. تجانس بلطف باستخدام micropipette لضمان تجانس الحل. ضع الخلية في غرفة الحرارة في مقياس الطيف الضوئي.
تعيين الطول الموجي الإثارة إلى 295 نانومتر. سجل الطيف الفلوري الجوهري N-Domain. إضافة ANS والحصول على الطيف الفلوري عن طريق الإثارة على طول موجي من 295 نانومتر.
إضافة اثنين من aliquot ميكرولتر من 100 ميكرومولار ANS الأسهم الحل إلى N-المجال المعلقة للحصول على تركيز نهائي ANS 0.2 ميكرومولار. تجانس بلطف، وذلك باستخدام micropipette لضمان تجانس هذا الحل. سجل طيف الفلورسينس.
كرر إضافات ANS والتسجيل الطيفي الفلوري كما هو موضح أعلاه لعلاقة 1:1 ANS N-Domain الأضراس. طرح الطيف الفارغ من كل طيف باستخدام البرامج. رسم جميع الأطياف في رسم بياني واحد تحديد ما إذا كان يتم تشكيل نمط مثل FRET من الطيف.
تشكل أطياف الفلورسينس ANS N-Domain نمطا يشبه FRET. N-المجال الجوهرية المعايرة فلوريسنسي عن طريق تعديل التربتوفان الكيميائية مع NBS. الحصول مرة أخرى على الطيف الفلوري الجوهري للمجال N.
إضافة واحد aliquot ميكرولتر من واحد الحل الأسهم NBS ملليمولار إلى N-المجال المعلقة للحصول على تركيز نهائي من NBS ميكرومولار واحد. تجانس بلطف باستخدام micropipette لضمان تجانس الحل. سجل طيف الفلورسينس.
كرر إضافة NBS والتسجيل الطيفي الفلوري حتى يتم ملاحظة الحد الأدنى من إخماد الفلورية الجوهرية N-Domain. تجانس بلطف باستخدام micropipette لضمان تجانس الحل. طرح الطيف الفارغ من كل طيف باستخدام البرامج.
رسم جميع الأطياف في رسم بياني واحد. عدل NBS N-Domain مع ANS عن طريق تسجيل أطياف مضانة عند 25 درجة. إضافة ANS والحصول على الطيف الفلوري عن طريق الإثارة على طول موجي من 295 نانومتر.
تجانس بلطف باستخدام micropipette لضمان تجانس الحل. سجل طيف الفلورسينس. طرح الطيف الفارغ من كل طيف باستخدام البرامج.
رسم جميع الأطياف في رسم بياني واحد. تدعم أطياف الفلورسينس المتولدة أو تدحض حدوث FRET. أي عندما يحدث FRET ، لا يزيد مضان ANS والعكس بالعكس.
دليل على ربط ANS إلى N-Domain المعدل كيميائيا عن طريق الإثارة عند طول موجي يبلغ 370 نانومتر. إضافة ANS إلى NBS تعديل N-المجال وتسجيل الطيف المفلور الجوهري N-المجال عن طريق الإثارة في الطول الموجي من 370 نانومتر. طرح الطيف الفارغ من كل طيف باستخدام البرامج.
رسم جميع الأطياف في رسم بياني واحد. تأكيد ANS ملزمة إلى N-المجال من قبل زيادة كثافة مضان ANS. ANS ملزمة لN-المجال يظهر زيادة مضان عندما متحمس في الطول الموجي من 370 نانومتر.
نظرة عامة على النتائج. لوحة A.ANS N-المجال المعقدة عرض نمط مثل FRET عندما مثيرة في الطول الموجي من 295 نانومتر. لوحة B.NBS تروي الفلورية الجوهرية N-Domain عن طريق تعديل كيميائيا بقايا التربتوفان الوحيد في N-Domain المعدل كيميائيا.
لوحة C.The ANS الفلورية يزيد عندما مثيرة في الطول الموجي من 295 نانومتر. لوحة D.The ANS الفلورية يزيد أيضا عندما مثيرة في الطول الموجي من 370 نانومتر. لذلك ، فإن الإثارة المباشرة ل ANS عند طول موجي قدره 295 نانومتر هي المصدر الرئيسي لفلورة ANS عندما تكون ملزمة بموقع ربط ATP. الاستنتاجات.
ويمكن استخدام هذه المقايسات لتحديد وجود FRET بين بقايا التربتوفان و ANS في البروتينات. توضيح FRET، تأكيد أم لا، بين التربتوفان و ANS سوف تسمح لاستخلاص استنتاجات أفضل في الدراسات الهيكلية البروتين. قد يكون الفحص مفيدا أيضا عند استخدام الفلوروفوريس الأخرى.
