Esses ensaios podem ajudar a esclarecer o papel dos resíduos de triptofano em proteínas ao realizar estudos de vinculação da ANS. A fluorescência ans aumenta ao se ligar a locais estruturais específicos em proteínas. Às vezes, o local de ligação da ANS se localiza perto de um resíduo de triptofano com uma distância que sugere a existência de FRET entre o triptofano e a ANS.
A NBS media a modificação química dos resíduos de triptofano em proteínas, saciando sua fluorescência. Portanto, esses ensaios permitem determinar se os resíduos de triptofano contribuem para o aumento da intensidade de fluorescência da ANS pelo FRET. Neste trabalho, utilizamos um domínio de ligação de nucleotídeos recombinantes projetados da SERCA contendo mutações, com o objetivo de localizar um triptofano próximo ao local de ligação nucleotídeo onde a ANS também se liga.
Este ensaio é rápido e fácil de executar, daí sua principal vantagem. Determinação no silico da interação ANS e SERCA N-Domain. Gerar uma estrutura tridimensional da proteína por modelagem molecular usando o software de modelagem proteica preferido.
Identifique os resíduos de aminoácidos que formam o local de ligação nucleotídeo utilizando o software estrutural molecular preferido e determine a presença de resíduos de arginina e lisina. Estes são necessários para a vinculação ans e aumentar a intensidade de fluorescência. Devido à presença de resíduos de arginina e de lise no local de ligação nucleotídeos da SERCA, hipótesemos a vinculação da ANS ao N-Domínio.
No modelo 3D, os resíduos de aminoácidos que formam o local de ligação ATP são identificados e destacados em laranja. Da mesma forma, a mutação tyrosine-para-triptofano está localizada e destacada em azul. Realizar acoplamento molecular com ATP, FITC e ANS.
Os resultados de acoplamento mostram que a ANS se encaixa bem no local de ligação nucleotídeo, da mesma forma que ATP e FITC. FITC rotula o local de ligação de nucleotídeos. Calcule a distância molecular entre o resíduo do triptofano e a ANS.
20 angstroms parece ser uma distância adequada para fret. Realize a simulação dinâmica molecular do complexo ANS N-Domain para determinar a estabilidade da interação. Um tempo de simulação de 10 nanossegundos mostra a estabilidade do complexo.
Prossiga para realizar os experimentos in vitro. Expressão e purificação do recombinante N-Domain. Expresso e purificado, por cromatografia de afinidade, o recombinante N-Domain projetado.
Realize um SDS-PAGE da proteína purificada para determinar a pureza. Determine a concentração de proteínas por absorvância em um comprimento de onda de 280 nanômetros com o coeficiente de extinção do N-Domain. Monitore a formação do complexo ANS N-Domain com base nas alterações de intensidade de fluorescência do ANS e N-Domain.
Prepare uma solução de estoque ANS em N, N-Dimethylformamida. Pesar uma pequena quantidade de ANS, entre um a cinco miligramas. Dissolva ANS em um mL de volume final de N, N-Dimethylformamida.
Prepare uma solução de estoque ANS de 100 micromolar usando a solução ANS em N, N-Dimethylformamida. Misture a solução com vórtice de três a cinco vezes. Prepare a solução de estoque NBS em N, N-Dimethylformamida.
Pesar uma pequena quantidade de NBS, de um a cinco miligramas. Dissolva o NBS em um mL de N, N-Dimetilformamida. Prepare uma solução de estoque NBS milimona usando a solução NBS em N, N-Dimethylformamida.
Misture a solução com vórtice de três a cinco vezes. Titule o N-Domain com ANS e registe o espectro de fluorescência para excitação a um comprimento de onda de 295 nanômetros a 25 graus. Obtenha a linha de base do espectro de fluorescência.
Coloque um mL de tampão de fosfato de 50 milimilas com pH oito em um cuvette de quartzo de fluorescência de um mL. Posicione a célula na câmara celular termostata do espectotômetro e ajuste o comprimento de onda de excitação para 295 nanômetros. Regisso espectro de fluorescência.
O espectro de fluorescência do vazio mostra o pico da água, que tem que ser subtraído mais tarde. Obtenha o espectro de fluorescência intrínseca do N-Domain. Coloque 900 microliters de 50 mililitros tampão de fosfato com pH 8 em um cuvette de quartzo de fluorescência.
Adicione 100 microliters de suspensão N-Domain para produzir uma concentração final de um micromolar N-Domain. Homogeneize suavemente usando uma micropipette para garantir a homogeneidade da solução. Posicione a célula na câmara termosta do Espectotômetro.
Defina o comprimento de onda de excitação para 295 nanômetros. Registo o espectro de fluorescência intrínseca do N-Domain. Adicione ANS e obtenha o espectro de fluorescência por excitação em um comprimento de onda de 295 nanômetros.
Adicione uma alíquota de dois microliter de 100 soluções de estoque ANS micromolar ao N-Domain suspenso para obter uma concentração final de 0,2 micromolar ANS. Homogeneize suavemente, utilizando uma micropipette para garantir a homogeneidade desta solução. Regisso espectro de fluorescência.
Repita as adições ans e a gravação espectral de fluorescência, conforme descrito acima para uma relação molar de 1:1 ANS N-Domain. Subtraia o espectro em branco de cada espectro usando software. Plote todos os espectros em um único gráfico Determine se um padrão semelhante ao FRET é formado pelo espectro.
Os espectros de fluorescência ans n-domain formam um padrão semelhante ao FRET. Titulação intrínseca de floresnce do N-Domain por modificação química do triptofano com NBS. Obtenha novamente o espectro de fluorescência intrínseca do N-Domain.
Adicione uma alíquota de um microliter de uma solução de estoque de NBS mililitro ao N-Domain suspenso para obter uma concentração final de um NBS micromolar. Homogeneize suavemente usando uma micropipette para garantir a homogeneidade da solução. Regisso espectro de fluorescência.
Repita a adição de NBS e a gravação espectral da fluorescência até que seja observada a saciação mínima de fluorescência intrínseca do N-Domain. Homogeneize suavemente usando uma micropipette para garantir a homogeneidade da solução. Subtraia o espectro em branco de cada espectro usando software.
Plote todos os espectros em um único gráfico. Titular o N-Domain modificado NBS com ANS registrando espectros de fluorescência a 25 graus. Adicione ANS e obtenha o espectro de fluorescência por excitação em um comprimento de onda de 295 nanômetros.
Homogeneize suavemente usando uma micropipette para garantir a homogeneidade da solução. Regisso espectro de fluorescência. Subtraia o espectro em branco de cada espectro usando software.
Plote todos os espectros em um único gráfico. Os espectros de fluorescência gerados suportam ou refutam a ocorrência de FRET. Ou seja, quando o FRET ocorre, a fluorescência ans não aumenta e vice-versa.
Evidência de ans vinculando-se ao N-Domain quimicamente modificado por excitação a um comprimento de onda de 370 nanômetros. Adicione ANS ao N-Domain modificado NBS e regissou o espectro de fluorescência intrínseca do N-Domain por excitação a um comprimento de onda de 370 nanômetros. Subtraia o espectro em branco de cada espectro usando software.
Plote todos os espectros em um único gráfico. Confirme a vinculação ans ao N-Domain pela intensidade crescente de fluorescência ans. A vinculação ans ao N-Domain mostra um aumento de fluorescência quando excitada em um comprimento de onda de 370 nanômetros.
Visão geral dos resultados. O complexo de 295 nanôs do painel A.ANS exibe um padrão semelhante ao FRET quando excitante em um comprimento de onda de 295 nanômetros. Painel B.NBS saciar a fluorescência intrínseca N-Domain modificando quimicamente o único resíduo de triptofano no N-Domain quimicamente modificado.
Painel C.A fluorescência ANS aumenta quando excitante em um comprimento de onda de 295 nanômetros. Painel D.A fluorescência ANS também aumenta quando excitante em um comprimento de onda de 370 nanômetros. Portanto, a excitação direta da ANS em um comprimento de onda de 295 nanômetros é a principal fonte de fluorescência ans quando está vinculado ao local de ligação ATP. Conclusões.
Estes ensaios podem ser usados para determinar a existência de FRET entre resíduos de triptofano e ANS em proteínas. O esclarecimento da FRET, confirmação ou não, entre triptofano e ANS permitirá tirar melhores conclusões em estudos estruturais proteicos. O ensaio também pode ser útil ao usar outros fluoroforos.
