这些分析可能有助于澄清色氨酸残留物在蛋白质中的作用，当执行ANS结合研究。ANS 荧光在与蛋白质中的特定结构位点结合时增加。有时 ANS 绑定站点位于色氨酸残留物附近，距离表明色氨酸和 ANS 之间存在 FRET。
NBS调解蛋白质中色氨酸残留物的化学修饰，淬火。因此，这些检测允许确定色氨酸残留物是否有助于FRET增加ANS荧光强度。在这项工作中，我们使用 SERCA 的工程重组核苷酸结合域，其中包含突变，旨在定位在 ANS 也结合的核苷酸结合位点附近找到色氨酸。
这种检测是快速和容易执行，因此它的主要优势。确定 ANS 和 SERCA N 域交互的西里科。使用首选的蛋白质建模软件进行分子建模，生成蛋白质的三维结构。
使用首选分子结构软件识别形成核苷酸结合部位的氨基酸残留物，并确定精氨酸和赖氨酸残留物的存在。这些是ANS结合和增加荧光强度所必需的。由于 SERCA 核苷酸结合部位存在精氨酸和赖氨酸残留物，我们假设 ANS 与 N 域的结合。
在 3D 模型中，形成 ATP 结合位点的氨基酸残留物以橙色进行识别和突出显示。同样，酪氨酸到色氨酸突变的位置和突出显示为蓝色。与 ATP、FITC 和 ANS 进行分子对接。
对接结果表明，ANS 与 ATP 和 FITC 类似，在核苷酸结合位点中非常合适。FITC 标记核苷酸结合站点。计算色氨酸残留物和ANS之间的分子距离。
20 安格斯特罗姆似乎是弗雷特的适当距离。对ANS N-域复合物进行分子动态模拟，以确定相互作用的稳定性。10 纳秒的模拟时间显示了该复合体的稳定性。
继续进行体外实验。重组 N 域的表达和纯化。通过亲和色谱仪快速净化工程重组剂 N-Domain。
执行纯化蛋白的 SDS-PAGE 以确定纯度。以280纳米的波长吸收确定蛋白质浓度，并具有N-Domain灭绝系数。根据 ANS 和 N 域荧光强度变化监测 ANS N 域复合体的形成。
在 N，N-二甲基甲酰胺中准备 ANS 库存解决方案。称量少量ANS，在一到五毫克之间。将 ANS 溶解在 N、N-二甲基甲酰胺最终体积的一 mL 中。
使用 N-二甲基甲酰胺中的 ANS 溶液准备 100 微摩尔 ANS 库存溶液。通过三到五次涡旋混合溶液。在 N，N-二甲基甲酰胺中准备 NBS 股票解决方案。
称量少量的 NBS，一到五毫克。将 NBS 溶解在 N 的 1 mL 中，N-二甲基甲酰胺。使用 N-二甲基甲酰胺中的 NBS 溶液准备一毫摩尔 NBS 股票解决方案。
通过三到五次涡旋混合溶液。用ANS对N域进行滴答声，并在25度下记录295纳米波长的荧光光谱以激发。获取荧光谱基线。
将一毫升50毫摩尔磷酸盐缓冲器与pH8放在一毫升荧光石英中。将细胞放置在光谱仪的恒温细胞室中，并将激发波长设置为 295 纳米。记录荧光谱。
空白的荧光谱显示水的峰值，以后必须减去。获取 N 域的内在荧光谱。将 900 微升 50 毫摩尔磷酸盐缓冲器与 pH 8 放在荧光石英库维特中。
加入100微升N域悬浮器，产生一个微摩尔N域最终浓度。使用微管轻轻地同质化，以确保溶液的均匀性。将细胞放置在光谱仪的恒温室中。
将激发波长设置为 295 纳米。记录 N 域内在荧光谱。加入ANS，以295纳米的波长激发获得荧光谱。
在悬浮的 N 域中加入 2 个 100 微摩尔 ANS 库存溶液的微升 aliquot，以获得 0.2 微摩尔 ANS 最终浓度。轻轻地同质化，使用微管，以确保此解决方案的同质性。记录荧光谱。
重复上述 ANS 添加和荧光光谱记录，以实现 1:1 ANS N-Domain 摩尔关系。使用软件从每个频谱中减去空白频谱。绘制单个图形中的所有光谱，确定类似 FRET 的模式是否由频谱形成。
ANS N域荧光光谱形成类似FRET的模式。N 域内在荧光点子通过色氨酸化学修改与 Nbs 。再次获取 N 域的内在荧光谱。
在悬浮的 N 域中添加一毫摩尔 NBS 库存溶液的一微升 aliquot，以获得一个微摩尔 NBS 的最终浓度。使用微管轻轻地同质化，以确保溶液的均匀性。记录荧光谱。
重复 NBS 添加和荧光光谱记录，直到观察到最小的 N 域内荧光淬火。使用微管轻轻地同质化，以确保溶液的均匀性。使用软件从每个频谱中减去空白频谱。
在单个图形中绘制所有光谱。通过在 25 度记录荧光光谱来用 ANS 对 N 字段进行修饰。加入ANS，以295纳米的波长激发获得荧光谱。
使用微管轻轻地同质化，以确保溶液的均匀性。记录荧光谱。使用软件从每个频谱中减去空白频谱。
在单个图形中绘制所有光谱。生成的荧光光谱支持或反驳FRET的发生。即当 FRET 发生时，ANS 荧光不会增加，反之亦然。
ANS 以 370 纳米的波长激发与化学改性 N 域结合的证据。将 ANS 添加到 NBS 修改的 N 域中，并通过 370 纳米的激发记录 N 域内在荧光谱。使用软件从每个频谱中减去空白频谱。
在单个图形中绘制所有光谱。通过增加 ANS 荧光强度确认 ANS 与 N 域结合。与 N 域结合的 ANS 显示在 370 纳米的波长下兴奋时荧光增加。
结果概述。面板 A.ANS N-Domain 复合体在波长为 295 纳米时显示类似 FRET 的图案。面板 B.NBS 通过化学修改化学修改的 N 域中唯一的色氨酸残留物来抑制 N 域内在荧光。
面板 C.ANS 荧光在波长为 295 纳米时增加。面板 D. ANS 荧光在波长为 370 纳米时也会增加。因此，在波长为 295 纳米的 ANS 直接激发是 ANS 荧光的主要来源，当它与 ATP 结合部位绑定时。结论。
这些检测可用于确定蛋白质中的色氨酸残留物和ANS之间存在FRET。色氨酸和ANS之间对FRET的澄清，是否确认，将允许在蛋白质结构研究中得出更好的结论。使用其他荧光片时，检测可能也很有用。
