בדיקות אלה עשויות לעזור להבהיר את התפקיד של שאריות טריפטופן בחלבונים בעת ביצוע מחקרים מחייב ANS. הפלואורסצנטיות של ANS עולה עם קשירה לאתרים מבניים ספציפיים בחלבונים. לפעמים אתר איגוד ANS מאתר קרוב לשאריות טריפטופן עם מרחק המצביע על קיומו של FRET בין טריפטופן ו- ANS.
NBS מתווך שינוי כימי של שאריות טריפטופן בחלבונים, מרווה את הפלואורסצנטיות שלה. לכן, בדיקות אלה מאפשרות לקבוע אם שאריות טריפטופן לתרום לעלייה בעוצמת פלואורסצנטיות ANS על ידי FRET. בעבודה זו, אנו משתמשים בתחום איגוד נוקלאוטידים רקומביננטי מהונדס מ- SERCA המכיל מוטציות, במטרה לאתר טריפטופן קרוב לאתר כריכת הנוקלאוטיד שבו ANS גם נקשר.
מעש זה מהיר וקל לביצוע, ומכאן היתרון העיקרי שלו. נחישות בסיליקו של אינטראקציית ANS ו- SERCA N-Domain. צור מבנה תלת מימדי של החלבון על ידי מידול מולקולרי באמצעות תוכנת מידול החלבון המועדפת.
זהה את שאריות חומצת האמינו היוצרות את אתר כריכת הנוקלאוטיד באמצעות התוכנה המבנית המולקולרית המועדפת ולקבוע את נוכחותם של שאריות ארגינין וליצין. אלה נדרשים עבור כריכת ANS ולהגדיל את עוצמת הפלואורסצנטיות. בגלל נוכחותם של שאריות ארגינין וליצין באתר כריכת הנוקלאוטיד של SERCA, אנו משערים את הכריכה של ANS ל- N-Domain.
בדגם 3D, שאריות חומצת האמינו היוצרות את אתר כריכת ה- ATP מזוהות ומודגשות בכתום. באופן דומה, המוטציה טירוסין-לטריפטופן ממוקם ומודגש בכחול. בצע עגינה מולקולרית עם ATP, FITC ו- ANS.
תוצאות עגינה מראות כי ANS מתאים היטב באתר כריכת הנוקלאוטיד, בדומה ל- ATP ו- FITC. FITC מתייגת את אתר איגוד הנוקלאוטיד. לחשב את המרחק המולקולרי בין שאריות טריפטופן ו ANS.
20 אנגסטרום נראה מרחק ראוי עבור FRET. בצע סימולציה דינמית מולקולרית של קומפלקס ANS N-Domain כדי לקבוע את יציבות האינטראקציה. זמן סימולציה של 10 ננו-שניות מראה את יציבות המתחם.
המשך לבצע את הניסויים במבחנה. ביטוי וטיהור של N-Domain רקומביננטי. לבטא ולטהר, על ידי כרומטוגרפיה זיקה, N-Domain רקומביננטי מהונדס.
בצע SDS-PAGE של החלבון המטוהר כדי לקבוע את הטוהר. קבע את ריכוז החלבון על ידי ספיגה באורך גל של 280 ננומטר עם מקדם ההכחדה N-Domain. נטר את היווצרותו של מתחם ANS N-Domain בהתבסס על שינויי עוצמת הפלואורסצנטיות ANS ו- N-Domain.
הכן פתרון מלאי ANS ב N, N-דימתילפורמיד. שוקל כמות קטנה של ANS, בין אחד לחמישה מיליגרם. להמיס ANS ב ML אחד של נפח סופי של N, N-דימתילפורמיד.
הכן פתרון מלאי ANS 100 micromolar באמצעות פתרון ANS ב N, N-דימתילפורמיד. מערבבים את הפתרון על ידי מערבולת שלוש עד חמש פעמים. הכן את פתרון המניות של אן-בי-אס ב-נ', אן-דימתילפורמיד.
לשקול כמות קטנה של NBS, אחד עד חמישה מיליגרם. להמיס את NBS ב ML אחד של N, N-דימתילפורמיד. הכן פתרון מניות NBS מילימולרי אחד באמצעות פתרון NBS ב N, N-דימתילפורמיד.
מערבבים את הפתרון על ידי מערבולת שלוש עד חמש פעמים. טירט את N-דומיין עם ANS ולתעד את ספקטרום פלואורסצנטיות עבור עירור באורך גל של 295 ננומטר ב 25 מעלות. להשיג את בסיס ספקטרום הפלואורסצנטיות.
הנח מ"ל אחד של 50 מילימולר חוצץ פוספט עם pH שמונה ב cuvette קוורץ פלואורסצנטית ML אחת. מקם את התא בתא התא התרמוסטטי של הספקטרופוטומטר והגדר את אורך גל העירור ל-295 ננומטר. תקליט את ספקטרום הפלואורסצנטיות.
ספקטרום הפלואורסצנטיות של הריק מראה את שיא המים, אשר יש להפחית מאוחר יותר. השג את ספקטרום הפלואורסצנטיות המהותי של N-Domain. מניחים 900 מיקרוליטרים של 50 מילימולר חוצץ פוספט עם pH 8 בקובט קוורץ פלואורסצנטי.
הוסף 100 מיקרוליטרים של השעיית N-Domain כדי להניב ריכוז סופי של N-Domain מיקרומולרי אחד. הומוגניזציה עדינה באמצעות מיקרופיט כדי להבטיח את ההומוגניות של הפתרון. מקם את התא בתא התרמוסטטי של הספקטרופוטומטר.
הגדר את אורך גל העירור ל 295 ננומטר. הקלט את ספקטרום הפלואורסצנטיות המהותית של N-Domain. הוסף ANS ולקבל את ספקטרום פלואורסצנטיות על ידי עירור אורך גל של 295 ננומטר.
הוסף שני aliquot microliter של 100 פתרון מניות ANS micromolar ל- N-Domain מושעה כדי לקבל ריכוז סופי ANS 0.2 מיקרומולר. הומוגני בעדינות, באמצעות מיקרופיט כדי להבטיח את ההומוגניות של פתרון זה. תקליט את ספקטרום הפלואורסצנטיות.
חזור על תוספות ANS והקלטת ספקטרלי פלואורסצנטי כמתואר לעיל עבור מערכת יחסים טוחנת N-Domain 1:1 ANS N-Domain. הפחת את הספקטרום הריק מכל ספקטרום באמצעות תוכנה. התווה את כל הספקטרום בגרף יחיד קבע אם תבנית דמוית FRET נוצרת על-ידי הספקטרום.
ספקטרום הפלואורסצנטיות ANS N-Domain יוצר תבנית דמוית FRET. N-דומיין נטיה פלורסצית מהותית על ידי שינוי כימי טריפטופן עם NBS. השג שוב את ספקטרום הפלואורסצנטיות המהותי של N-Domain.
הוסף aliquot microliter אחד של פתרון מניות NBS מילימולרי אחד N-Domain מושעה כדי להשיג ריכוז סופי של NBS מיקרומולר אחד. הומוגניזציה עדינה באמצעות מיקרופיט כדי להבטיח את ההומוגניות של הפתרון. תקליט את ספקטרום הפלואורסצנטיות.
חזור על תוספת NBS והקלטת ספקטרלי פלואורסצנטי עד תצפית פלואורסצנטית פנימית N-Domain מינימלית. הומוגניזציה עדינה באמצעות מיקרופיט כדי להבטיח את ההומוגניות של הפתרון. הפחת את הספקטרום הריק מכל ספקטרום באמצעות תוכנה.
התווה את כל הספקטרום בגרף יחיד. טירט NBS שונה N-דומיין עם ANS על ידי הקלטת ספקטרום פלואורסצנטי ב 25 מעלות. הוסף ANS ולקבל את ספקטרום פלואורסצנטיות על ידי עירור אורך גל של 295 ננומטר.
הומוגניזציה עדינה באמצעות מיקרופיט כדי להבטיח את ההומוגניות של הפתרון. תקליט את ספקטרום הפלואורסצנטיות. הפחת את הספקטרום הריק מכל ספקטרום באמצעות תוכנה.
התווה את כל הספקטרום בגרף יחיד. ספקטרום פלואורסצנטיות שנוצר תומך או להפריך את המופע של FRET. כלומר כאשר FRET מתרחשת, פלואורסצנטיות ANS אינה גדלה ולהיפך.
ראיות של ANS מחייב N-Domain שונה כימית על ידי עירור באורך גל של 370 ננומטר. הוסף ANS ל- N-Domain שונה NBS ורשום את ספקטרום הפלואורסצנטיות המהותית N-Domain על ידי עירור באורך גל של 370 ננומטר. הפחת את הספקטרום הריק מכל ספקטרום באמצעות תוכנה.
התווה את כל הספקטרום בגרף יחיד. אשר איגוד ANS ל- N-Domain על-ידי עוצמת הפלואורסצנטיות הגוברת של ANS. איגוד ANS ל- N-Domain מראה עלייה פלואורסצנטית כאשר נרגשים באורך גל של 370 ננומטר.
מבט כולל על התוצאות. קומפלקס פאנל A.ANS N-Domain מציג תבנית דמוית FRET כאשר הוא מרגש באורך גל של 295 ננומטר. פאנל B.NBS להרוות את פלואורסצנטיות מהותית N-דומיין על ידי שינוי כימי שאריות טריפטופן הבלעדי ב N-Domain שונה כימית.
פאנל C.THE ANS פלואורסצנטיות עולה כאשר מרגש אורך גל של 295 ננומטר. פאנל D.THE הפלואורסצנטיות של ANS גדל גם כאשר מרגש אורך גל של 370 ננומטר. לכן, עירור ישיר של ANS אורך גל של 295 ננומטר הוא המקור העיקרי של פלואורסצנטיות ANS כאשר הוא מאוגד לאתר כריכת ATP. מסקנות.
בדיקות אלה עשויות לשמש כדי לקבוע את קיומו של FRET בין שאריות טריפטופן ו ANS בחלבונים. ההבהרה של FRET, אישור או לא, בין טריפטופן ו ANS יאפשר להסיק מסקנות טובות יותר במחקרים מבניים חלבון. ההסתה עשויה להיות שימושית גם בעת שימוש פלואורופור אחרים.
