Estos ensayos pueden ayudar a aclarar el papel de los residuos de triptófano en las proteínas al realizar estudios de unión al SNA. La fluorescencia del SNA aumenta al unirse a sitios estructurales específicos en las proteínas. A veces, el sitio de unión al SNA se localiza cerca de un residuo de triptófano con una distancia que sugiere la existencia de FRET entre el triptófano y el SNA.
NBS media la modificación química de los residuos de triptófano en las proteínas, apagando su fluorescencia. Por lo tanto, estos ensayos permiten determinar si los residuos de triptófano contribuyen al aumento de la intensidad de fluorescencia del SÁN por FRET. En este trabajo, utilizamos un dominio de unión a nucleótidos recombinantes diseñado de SERCA que contiene mutaciones, con el objetivo de localizar un triptófano cerca del sitio de unión a nucleótidos donde también se une el SNA.
Este ensayo es rápido y fácil de realizar, de ahí su principal ventaja. Determinación in silico de la interacción ANS y SERCA N-Domain. Generar una estructura tridimensional de la proteína mediante modelado molecular utilizando el software de modelado de proteínas preferido.
Identifique los residuos de aminoácidos que forman el sitio de unión a nucleótidos utilizando el software estructural molecular preferido y determine la presencia de residuos de arginina y lisina. Estos son necesarios para la unión al SNA y aumentan la intensidad de la fluorescencia. Debido a la presencia de residuos de arginina y lisina en el sitio de unión a nucleótidos de SERCA, planteamos la hipótesis de la unión de ANS al dominio N.
En el modelo 3D, los residuos de aminoácidos que forman el sitio de unión al ATP se identifican y resaltan en naranja. Del mismo modo, la mutación de tirosina a triptófano se localiza y resalta en azul. Realice acoplamiento molecular con ATP, FITC y ANS.
Los resultados de acoplamiento muestran que anS encaja bien en el sitio de unión de nucleótidos, de manera similar a ATP y FITC. FITC etiqueta el sitio de unión de nucleótidos. Calcular la distancia molecular entre el residuo de triptófano y el SNA.
20 angstroms parece ser una distancia adecuada para FRET. Realizar simulación dinámica molecular del complejo ANS N-Domain para determinar la estabilidad de la interacción. Un tiempo de simulación de 10 nanosegundos muestra la estabilidad del complejo.
Proceda a realizar los experimentos in vitro. Expresión y purificación del Dominio N recombinante. Expresar y purificar, mediante cromatografía de afinidad, el dominio N recombinante diseñado.
Realice un SDS-PAGE de la proteína purificada para determinar la pureza. Determinar la concentración de proteínas por absorbancia a una longitud de onda de 280 nanómetros con el coeficiente de extinción del dominio N. Monitorear la formación del complejo ANS N-Domain basado en los cambios de intensidad de fluorescencia ans y N-Domain.
Preparar una solución de caldo ans en N, N-dimetilformamida. Pesar una pequeña cantidad de SAN, entre uno y cinco miligramos. Disolver el SÁN en un ml de volumen final de N, N-dimetilformamida.
Preparar una solución madre de SNA micromolar de 100 micromolares utilizando la solución de SNA en N, N-Dimetilformamida. Mezcle la solución vórtice de tres a cinco veces. Preparar la solución de stock de NBS en N, N-Dimetilformamida.
Pesar una pequeña cantidad de NBS, de uno a cinco miligramos. Disolver el NBS en un ml de N, N-dimetilformamida. Preparar una solución madre de NBS de un milimolar utilizando la solución de NBS en N, N-dimetilformamida.
Mezcle la solución vórtice de tres a cinco veces. Valore el dominio N con ANS y registre los espectros de fluorescencia para la excitación a una longitud de onda de 295 nanómetros a 25 grados. Obtener la línea de base del espectro de fluorescencia.
Coloque un ml de tampón de fosfato milimolar de 50 con pH ocho en una cubeta de cuarzo de fluorescencia de un ml. Coloque la celda en la cámara de celda termostatada del espectrofotómetro y ajuste la longitud de onda de excitación a 295 nanómetros. Registre el espectro de fluorescencia.
El espectro de fluorescencia del espacio en blanco muestra el pico de agua, que debe restarse más tarde. Obtener el espectro de fluorescencia intrínseca del Dominio N. Coloque 900 microlitros de tampón de fosfato milimolar de 50 con pH 8 en una cubeta de cuarzo de fluorescencia.
Agregue 100 microlitros de suspensión de N-Domain para producir una concentración final de N-Domain micromolar. Homogeneizar suavemente utilizando una micropipeta para asegurar la homogeneidad de la solución. Coloque la celda en la cámara termostatada del espectrofotómetro.
Establezca la longitud de onda de excitación en 295 nanómetros. Registre el espectro de fluorescencia intrínseca del dominio N. Agregue ANS y obtenga el espectro de fluorescencia por excitación a una longitud de onda de 295 nanómetros.
Añadir una alícuota de dos microlitros de solución madre de SNA micromolar de 100 micromolares al dominio N suspendido para obtener una concentración final de SNA micromolar de 0,2. Homogeneizar suavemente, utilizando una micropipeta para asegurar la homogeneidad de esta solución. Registre el espectro de fluorescencia.
Repita las adiciones de ANS y el registro espectral de fluorescencia como se describió anteriormente para una relación molar N-Dominio anS 1:1. Reste el espectro en blanco de cada espectro utilizando software. Trazar todos los espectros en un solo gráfico Determinar si un patrón similar a FRET está formado por el espectro.
Los espectros de fluorescencia del dominio N de ANS forman un patrón similar a FRET. Valoración de florescencia intrínseca del dominio N por modificación química de triptófano con NBS. Obtener de nuevo el espectro de fluorescencia intrínseca del Dominio N.
Agregue una alícuota de un microlitro de una solución madre de NBS milimolar al dominio N suspendido para obtener una concentración final de un NBS micromolar. Homogeneizar suavemente utilizando una micropipeta para asegurar la homogeneidad de la solución. Registre el espectro de fluorescencia.
Repita la adición de NBS y el registro espectral de fluorescencia hasta que se observe un mínimo de enfriamiento de fluorescencia intrínseca del dominio N. Homogeneizar suavemente utilizando una micropipeta para asegurar la homogeneidad de la solución. Reste el espectro en blanco de cada espectro utilizando software.
Traza todos los espectros en un solo gráfico. Valore el dominio N modificado NBS con ANS registrando espectros de fluorescencia a 25 grados. Agregue ANS y obtenga el espectro de fluorescencia por excitación a una longitud de onda de 295 nanómetros.
Homogeneizar suavemente utilizando una micropipeta para asegurar la homogeneidad de la solución. Registre el espectro de fluorescencia. Reste el espectro en blanco de cada espectro utilizando software.
Traza todos los espectros en un solo gráfico. Los espectros de fluorescencia generados apoyan o refutan la ocurrencia de FRET. Es decir, cuando se produce FRET, la fluorescencia del SÁN no aumenta y viceversa.
Evidencia de unión del SNA al dominio N modificado químicamente por excitación a una longitud de onda de 370 nanómetros. Agregue ANS al dominio N modificado NBS y registre el espectro de fluorescencia intrínseca del dominio N por excitación a una longitud de onda de 370 nanómetros. Reste el espectro en blanco de cada espectro utilizando software.
Traza todos los espectros en un solo gráfico. Confirme la unión del SNA al dominio N mediante el aumento de la intensidad de la fluorescencia del SNA. La unión del SNA al dominio N muestra un aumento de fluorescencia cuando se excita a una longitud de onda de 370 nanómetros.
Resumen de resultados. El panel A.ANS del complejo N-Domain muestra un patrón similar a FRET cuando se excita a una longitud de onda de 295 nanómetros. El Panel B.NBS apaga la fluorescencia intrínseca del Dominio N modificando químicamente el único residuo de triptófano en el Dominio N modificado químicamente.
Panel C.La fluorescencia ANS aumenta cuando se excita a una longitud de onda de 295 nanómetros. Panel D.La fluorescencia ANS también aumenta cuando se excita a una longitud de onda de 370 nanómetros. Por lo tanto, la excitación directa del SNA a una longitud de onda de 295 nanómetros es la principal fuente de fluorescencia del SNA cuando se une al sitio de unión al ATP. Conclusiones.
Estos ensayos pueden utilizarse para determinar la existencia de FRET entre los residuos de triptófano y el SNA en las proteínas. La clarificación de FRET, confirmación o no, entre triptófano y SNA permitirá sacar mejores conclusiones en estudios estructurales de proteínas. El ensayo también puede ser útil cuando se usan otros fluoróforos.
