これらのアッセイは、ANS結合試験を行う際に、タンパク質におけるトリプトファン残基の役割を明らかにするのに役立つ可能性がある。ANS蛍光は、タンパク質中の特定の構造部位に結合すると増加します。時にはANS結合部位は、トリプトファンとANSの間のFRETの存在を示唆する距離を有するトリプトファン残基の近くに位置する。
NBSは、タンパク質中のトリプトファン残基の化学修飾を仲介し、その蛍光を消光する。したがって、これらのアッセイは、トリプトファン残基がFRETによるANS蛍光強度の増加に寄与するかどうかを決定することを可能にする。本研究では、変異を含むSERCAから作製された組換えヌクレオチド結合ドメインを用いて、ANSも結合するヌクレオチド結合部位に近いトリプトファンを見つけることを目指す。
このアッセイは迅速かつ実行が容易であるため、その主な利点です。ANSとSERCA Nドメイン相互作用のインシリコにおける決定好ましいタンパク質モデリングソフトウェアを用いて分子モデリングによりタンパク質の立体構造を生成する。
好ましい分子構造ソフトウェアを用いてヌクレオチド結合部位を形成するアミノ酸残基を特定し、アルギニンおよびリジン残基の存在を決定する。これらはANS結合に必要であり、蛍光強度を高める。SERCAのヌクレオチド結合部位にアルギニンおよびリジン残基が存在するため、ANSのNドメインへの結合を仮説する。
3Dモデルでは、ATP結合部位を形成するアミノ酸残基がオレンジ色で同定され、強調表示される。同様に、チロシンからトリプトファンへの突然変異は、青で位置し、強調されている。ATP、FITC、およびANSで分子ドッキングを行います。
ドッキング結果は、ANSがATPおよびFITCと同様に、ヌクレオチド結合部位にうまく適合することを示す。FITCは、ヌクレオチド結合部位にラベルを付けます。トリプトファン残基とANSの間の分子距離を計算します。
20オングストロームはFRETにとって適切な距離のようです。ANS N-ドメイン複合体の分子動的シミュレーションを行い、相互作用の安定性を決定します。10ナノ秒のシミュレーション時間は、複合体の安定性を示しています。
インビトロ実験を行う。組換えNドメインの発現および精製急行精製は、アフィニティークロマトグラフィーにより、組換えNドメインを組み換えする。
精製したタンパク質のSDS-PAGEを実行して、純度を決定します。N-ドメインの消滅係数を用いて、280ナノメートルの波長の吸光度でタンパク質濃度を決定します。ANSおよびN-ドメイン蛍光強度変化に基づいて、ANS Nドメイン複合体の形成を監視します。
N、N-ジメチルホルムアミドでANSストック溶液を調製する。少量のANSの重量を量ります, 間 1 から 5 ミリグラム.Nの最終容積の1mL、N-ジメチルホルムアミドにANSを溶解する。
N,N-ジメチルホルムアミドのANS溶液を用いて100マイクロモルANSストック溶液を調製する。3~5回ボルテックスで溶液を混ぜます。NBSストック溶液をN、N-ジメチルホルムアミドで調製する。
少量のNBS,1~5ミリグラムの重量を量る。NBSをN-ジメチルホルムアミドの1 mLに溶解する。N-ジメチルホルムアミド中のNBS溶液を用いて1ミリモルNBSストック溶液を調製する。
3~5回ボルテックスで溶液を混ぜます。N-ドメインをANSで計り、25度で295ナノメートルの波長で励起するための蛍光スペクトルを記録します。蛍光スペクトルベースラインを取得する。
1 mL 蛍光クォーツキュベットに pH 8 を含む 50 ミリモルリン酸緩衝液の 1 mL を入れます。分光光度計の熱式セルチャンバーにセルを配置し、励起波長を295ナノメートルに設定します。蛍光スペクトルを記録します。
ブランクの蛍光スペクトルは、後で減算しなければならない水のピークを示しています。Nドメインの本来の蛍光スペクトルを得る。蛍光クォーツキュベットにpH 8と共に50ミリモルリン酸緩衝液900マイクロリットルを入れます。
1マイクロモルN-ドメイン最終濃度を得るために100マイクロリットルのN-ドメイン懸濁液を加える。溶液の均質性を確保するために、マイクロピペットを使用して穏やかに均質化します。分光光度計の熱式チャンバーにセルを置きます。
励起波長を295ナノメートルに設定します。N-ドメイン固有蛍光スペクトルを記録します。ANSを追加し、295ナノメートルの波長で励起することにより蛍光スペクトルを得る。
100マイクロモルANSストック溶液の2マイクロリットルアリコートを懸濁Nドメインに加え、0.2マイクロモルANS最終濃度を得る。マイクロピペットを使用して、この溶液の均質性を確保し、穏やかに均質化する。蛍光スペクトルを記録します。
1:1 ANS N-ドメインモル関係について、上記のようにANSの追加と蛍光スペクトル記録を繰り返します。ソフトウェアを使用して、各スペクトルから空白のスペクトルを差し引きます。1つのグラフにすべてのスペクトルをプロット FRET のようなパターンがスペクトルによって形成されているかどうかを判断します。
ANS N-ドメイン蛍光スペクトルは、FRET様パターンを形成する。N-ドメイン内の固有の蛍光滴定は、NBSによるトリプトファン化学修飾による。Nドメインの本来の蛍光スペクトルを再度得る。
1ミリモルNBSストック溶液の1マイクロリットルのアリコートを懸濁Nドメインに加え、1マイクロモルNBSの最終濃度を得る。溶液の均質性を確保するために、マイクロピペットを使用して穏やかに均質化します。蛍光スペクトルを記録します。
最小のN-ドメイン固有蛍光消光が観察されるまで、NBS付加および蛍光スペクトル記録を繰り返す。溶液の均質性を確保するために、マイクロピペットを使用して穏やかに均質化します。ソフトウェアを使用して、各スペクトルから空白のスペクトルを差し引きます。
すべてのスペクトルを 1 つのグラフにプロットします。蛍光スペクトルを25度で記録することにより、NBS修飾NドメインをANSで評価します。ANSを追加し、295ナノメートルの波長で励起することにより蛍光スペクトルを得る。
溶液の均質性を確保するために、マイクロピペットを使用して穏やかに均質化します。蛍光スペクトルを記録します。ソフトウェアを使用して、各スペクトルから空白のスペクトルを差し引きます。
すべてのスペクトルを 1 つのグラフにプロットします。生成された蛍光スペクトルは、FRETの発生を支持または反論する。すなわち、FRETが発生すると、ANS蛍光は増加せず、その逆もまた同様である。
370ナノメートルの波長で励起することにより、化学的に修飾されたNドメインにANS結合の証拠。NBS改変N-ドメインにANSを加え、370ナノメートルの波長で励起してNドメイン固有蛍光スペクトルを記録します。ソフトウェアを使用して、各スペクトルから空白のスペクトルを差し引きます。
すべてのスペクトルを 1 つのグラフにプロットします。ANS蛍光強度の上昇によりNドメインに結合するANSを確認する。N-Domainに結合するANSは、370ナノメートルの波長で励起されると蛍光増加を示す。
結果の概要。パネルA.ANS N-ドメイン複合体は、295ナノメートルの波長で励起するときのFRET様パターンを表示します。パネルB.NBSは、化学的に修飾されたNドメイン内の唯一のトリプトファン残基を化学的に改変することによって、Nドメイン固有蛍光をクエンチする。
パネルC.ANS蛍光は295ナノメートルの波長で励起すると増加する。パネルD.ANS蛍光はまた370ナノメートルの波長で励まされると増加する。したがって、295ナノメートルの波長でのANSの直接励起は、ATP結合部位に結合する場合のANS蛍光の主な供給源である。結論。
これらのアッセイは、タンパク質中のトリプトファン残基とANSとの間にFRETの存在を決定するために使用され得る。TRYptopanとANSの間のFRETの明確化は、タンパク質構造研究でより良い結論を引き出すことを可能にする。このアッセイは、他のフルオロフォアを使用する場合にも有用である。
