Bu tahliller, ANS bağlama çalışmaları yapılırken triptofan kalıntılarının proteinlerdeki rolünü netleştirmeye yardımcı olabilir. ANS floresan proteinlerdeki belirli yapısal bölgelere bağlanınca artar. Bazen ANS bağlama bölgesi, triptofan ve ANS arasında FRET varlığını düşündüren bir mesafeye sahip bir triptofan kalıntısına yakın bir yer bular.
NBS, proteinlerdeki triptofan kalıntılarının kimyasal modifikasyonunu aracılık ederek floresanını söndürür. Bu nedenle, bu tahliller triptofan kalıntılarının FRET tarafından ANS floresan yoğunluğunun artmasına katkıda bulunup bulunmadığının belirlenmesine izin verir. Bu çalışmada, ANS'nin de bağlandığı nükleotid bağlama bölgesine yakın bir triptofan bulmayı amaçlayan, mutasyon içeren SERCA'dan tasarlanmış bir rekombinant nükleotid bağlama etki alanı kullanıyoruz.
Bu tahlil hızlı ve gerçekleştirilmesi kolaydır, bu nedenle ana avantajıdır. ANS ve SERCA N-Domain etkileşiminin silikosunda kararlılık. Tercih edilen protein modelleme yazılımını kullanarak moleküler modelleme ile proteinin üç boyutlu bir yapısını oluşturun.
Tercih edilen moleküler yapısal yazılımı kullanarak nükleotid bağlama bölgesini oluşturan amino asit kalıntılarını tanımlayın ve arginin ve lizin kalıntılarının varlığını belirleyin. Bunlar ANS bağlama için gereklidir ve floresan yoğunluğunu arttırır. SERCA'nın nükleotid bağlama bölgesinde arginin ve lizin kalıntıları bulunması nedeniyle, ANS'nin N-Domain'e bağlanmasını hipotez ediyoruz.
3D modelde, ATP bağlama bölgesini oluşturan amino asit kalıntıları turuncu renkte tanımlanır ve vurgulanır. Benzer şekilde, tirozin-triptofan mutasyonu mavi ile bulunur ve vurgulanır. ATP, FITC ve ANS ile moleküler yerleştirme gerçekleştirin.
Yerleştirme sonuçları, ANS'nin ATP ve FITC'ye benzer şekilde nükleotid bağlama bölgesine iyi uyduğunu göstermektedir. FITC nükleotid bağlama bölgesini etiketler. Triptofan kalıntısı ile ANS arasındaki moleküler mesafeyi hesaplayın.
20 angstrom, FRET için uygun bir mesafe gibi görünüyor. Etkileşimin kararlılığını belirlemek için ANS N-Domain kompleksinin moleküler dinamik simülasyonunun gerçekleştiriliyor. 10 nanosaniyelik simülasyon süresi kompleksin kararlılığını gösterir.
Tüp bebek deneylerini yapmaya devam edin. Rekombinant N-Domain'in ifadesi ve saflaştırılması. Benzeşim kromatografisi ile mühendislik rekombinant N-Domain'i ifade edin ve arındırın.
Saflığı belirlemek için saflaştırılmış proteinin SDS PAGE'ini gerçekleştirin. N-Domain yok olma katsayısı ile 280 nanometre dalga boyunda emici ile protein konsantrasyonu belirleyin. ANS ve N-Domain floresan yoğunluğu değişikliklerine dayanarak ANS N-Domain kompleksinin oluşumunu izleyin.
N, N-Dimetilformamid'de bir ANS stok çözümü hazırlayın. Bir ila beş miligram arasında az miktarda ANS ağırlığındadır. ANS'yi N, N-Dimetilformamid'in son hacminin bir mL'sinde çözün.
N, N-Dimetilformamid'deki ANS çözümünü kullanarak 100 mikromolar ANS stok çözümü hazırlayın. Çözeltiyi üç ila beş kez girdaplayarak karıştırın. N-Dimetilformamid N,N-Dimetilformamid NBS stok çözüm hazırlayın.
Bir ila beş miligram olmak üzere az miktarda NBS ağırlığındadır. NBŞ'yi bir mL N, N-Dimetilformamid içinde çözün. N, N-Dimetilformamid'deki NBS çözümünü kullanarak bir milimolar NBS stok çözümü hazırlayın.
Çözeltiyi üç ila beş kez girdaplayarak karıştırın. ANS ile N-Domain titrate ve 25 derecede 295 nanometre dalga boyunda heyecan için floresan spektrumu kaydedin. Floresan spektrum taban çizgisini elde edin.
Bir mL floresan kuvars cuvette içine pH sekiz ile 50 milimoler fosfat tamponunun bir mL'sini yerleştirin. Hücreyi spektrofotometrenin termostatlı hücre odasına yerleştirin ve heyecan dalga boyunu 295 nanometreye ayarlayın. Floresan spektrumu kaydedin.
Boşluğun floresan spektrumu, daha sonra çıkarılması gereken suyun zirvesini gösterir. N-Domain'in iç floresan spektrumunun eldeini elde edin. 900 mikrolitre 50 milimoler fosfat tamponu pH 8 ile floresan kuvars cuvette yerleştirin.
Bir mikromoler N-Domain son konsantrasyonu elde etmek için 100 mikrolitre N-Domain süspansiyon ekleyin. Çözeltinin homojenliğini sağlamak için bir mikropipette kullanarak hafifçe homojenize edin. Hücreyi Spektrofotometrenin termostatlı odasına yerleştirin.
Heyecan dalga boyunu 295 nanometreye ayarlayın. N-Domain iç floresan spektrumu kaydedin. ANS ekleyin ve 295 nanometre dalga boyunda heyecanlanarak floresan spektrumunu elde edin.
0,2 mikromolar ANS son konsantrasyon elde etmek için askıya alınan N-Domain'e 100 mikromolar ANS stok çözeltisinin iki mikroliter aliquotunu ekleyin. Bu çözeltinin homojenliğini sağlamak için bir mikropipette kullanarak hafifçe homojenize edin. Floresan spektrumu kaydedin.
1:1 ANS N-Domain molar ilişkisi için ans eklemelerini ve floresan spektral kaydını yukarıda açıklandığı gibi tekrarlayın. Yazılımı kullanarak her spektrumdan boş spektrumu çıkarın. Tüm spektrumları tek bir grafikte çizin Spektrum tarafından FRET benzeri bir desen oluşup oluşmadığını belirleyin.
ANS N-Domain floresan spektrumu FRET benzeri bir desen oluşturur. N-Domain iç florescence titrasyon NBS ile triptofan kimyasal modifikasyon ile. N-Domain'in iç floresan spektrumu tekrar elde edin.
Bir mikromoler NBS'nin son konsantrasyonunu elde etmek için askıya alınan N-Domain'e bir milimoler NBS stok çözeltisinin bir mikrolitre aliquotunu ekleyin. Çözeltinin homojenliğini sağlamak için bir mikropipette kullanarak hafifçe homojenize edin. Floresan spektrumu kaydedin.
NBŞ ilavesini ve floresan spektral kaydını minimal N-Domain iç floresan söndürmesi gözlenene kadar tekrarlayın. Çözeltinin homojenliğini sağlamak için bir mikropipette kullanarak hafifçe homojenize edin. Yazılımı kullanarak her spektrumdan boş spektrumu çıkarın.
Tüm spektrumları tek bir grafikte çizin. NBS modifiye N-Domain'i ANS ile 25 derecede floresan spektrumu kaydederek titrat. ANS ekleyin ve 295 nanometre dalga boyunda heyecanlanarak floresan spektrumunu elde edin.
Çözeltinin homojenliğini sağlamak için bir mikropipette kullanarak hafifçe homojenize edin. Floresan spektrumu kaydedin. Yazılımı kullanarak her spektrumdan boş spektrumu çıkarın.
Tüm spektrumları tek bir grafikte çizin. Oluşturulan floresan spektrumu FRET oluşumunu destekler veya çürütür. Yani FRET meydana geldiğinde, ANS floresan artmaz ve bunun tersi de artar.
ANS'nin kimyasal olarak değiştirilmiş N-Domain'e 370 nanometre dalga boyunda heyecanlanarak bağlanmış kanıtı. NBS modifiye N-Domain'e ANS ekleyin ve 370 nanometre dalga boyunda heyecanlanarak N-Domain iç floresan spektrumunu kaydedin. Yazılımı kullanarak her spektrumdan boş spektrumu çıkarın.
Tüm spektrumları tek bir grafikte çizin. Artan ANS floresan yoğunluğu ile N-Domain'e ANS bağlamasını onaylayın. N-Domain'e ans bağlama, 370 nanometre dalga boyunda heyecanlandığında floresan artışı gösterir.
Sonuçlara genel bakış. Panel A.ANS N-Domain kompleksi, 295 nanometre dalga boyunda heyecan verici olduğunda FRET benzeri bir desen görüntüler. Panel B.NBS, kimyasal olarak değiştirilmiş N-Domain'deki tek triptofan kalıntısını kimyasal olarak değiştirerek N-Domain iç floresanını söndürür.
Panel C.ANS floresan, 295 nanometre dalga boyunda heyecan verici olduğunda artar. Panel D.ANS floresan da 370 nanometre dalga boyunda heyecan verici olduğunda artar. Bu nedenle, ANS'nin 295 nanometre dalga boyunda doğrudan çıkarılması, ATP bağlama bölgesine bağlandığında ANS floresanının ana kaynağıdır. Sonuç.
Bu tahliller, proteinlerde triptofan kalıntıları ve ANS arasındaki FRET varlığını belirlemek için kullanılabilir. FRET'in triptofan ve ANS arasında doğrulansa da onaylanmasa da netleştirilmesi, protein yapısal çalışmalarında daha iyi sonuçlara varılmasını sağlayacaktır. Test, diğer floroforları kullanırken de yararlı olabilir.
