Ces essais peuvent aider à clarifier le rôle des résidus de tryptophane dans les protéines lors de la réalisation d’études de liaison au SNA. La fluorescence DU SNA augmente lors de la liaison à des sites structurels spécifiques dans les protéines. Parfois, le site de liaison ANS se trouve à proximité d’un résidu de tryptophane avec une distance qui suggère l’existence de FRET entre le tryptophane et le SNA.
Le NBS médie la modification chimique des résidus de tryptophane dans les protéines, éteignant sa fluorescence. Par conséquent, ces essais permettent de déterminer si les résidus de tryptophane contribuent à l’augmentation de l’intensité de fluorescence du SNA par FRET. Dans ce travail, nous utilisons un domaine de liaison de nucléotides recombinants de SERCA contenant des mutations, visant à localiser un tryptophane près du site de liaison aux nucléotides où ANS se lie également.
Ce test est rapide et facile à réaliser, d’où son principal avantage. Détermination in silico de l’interaction ANS et SERCA N-Domain. Générer une structure tridimensionnelle de la protéine par modélisation moléculaire à l’aide du logiciel de modélisation des protéines préféré.
Identifier les résidus d’acides aminés qui forment le site de liaison des nucléotides à l’aide du logiciel structurel moléculaire préféré et déterminer la présence de résidus d’arginine et de lysine. Ceux-ci sont nécessaires pour la liaison ANS et augmentent l’intensité de fluorescence. En raison de la présence de résidus d’arginine et de lysine dans le site de liaison nucléotidique de SERCA, nous émettons l’hypothèse de la liaison de l’ANS au domaine N.
Dans le modèle 3D, les résidus d’acides aminés formant le site de liaison de l’ATP sont identifiés et mis en évidence en orange. De même, la mutation tyrosine-tryptophane est localisée et mise en évidence en bleu. Effectuez un amarrage moléculaire avec ATP, FITC et ANS.
Les résultats de l’amarrage montrent que le SNA s’intègre bien dans le site de liaison des nucléotides, de la même manière que l’ATP et le FITC. FITC étiquette le site de liaison des nucléotides. Calculer la distance moléculaire entre le résidu de tryptophane et le SNA.
20 angstroms semble être une distance appropriée pour FRET. Effectuer une simulation dynamique moléculaire du complexe ANS N-Domain pour déterminer la stabilité de l’interaction. Un temps de simulation de 10 nanosecondes montre la stabilité du complexe.
Procédez à la pratique des expériences in vitro. Expression et purification du domaine N recombinant. Exprimer et purifier, par chromatographie d’affinité, le domaine N recombinant d’ingénierie.
Effectuez un SDS-PAGE de la protéine purifiée pour déterminer la pureté. Déterminer la concentration en protéines par absorbance à une longueur d’onde de 280 nanomètres avec le coefficient d’extinction du domaine N. Surveiller la formation du complexe ANS N-Domain en fonction des changements d’intensité de fluorescence ANS et N-Domain.
Préparer une solution sine qua non-diméthylformamide. Peser une petite quantité de SNA, entre un et cinq milligrammes. Dissoudre l’ANS dans un mL du volume final de N, N-diméthylformamide.
Préparer une solution mère de 100 micromolaires ANS en utilisant la solution ANS dans N, N-Diméthylformamide. Mélanger la solution en vortexant trois à cinq fois. Préparer la solution éramique NBS en N, N-Diméthylformamide.
Peser une petite quantité de NBS, un à cinq milligrammes. Dissoudre le NBS dans un mL de N, N-Diméthylformamide. Préparer une solution mère nbS d’un millimolaire en utilisant la solution NBS dans N, N-Diméthylformamide.
Mélanger la solution en vortexant trois à cinq fois. Titrer le domaine N avec ANS et enregistrer les spectres de fluorescence pour l’excitation à une longueur d’onde de 295 nanomètres à 25 degrés. Obtenir la ligne de base du spectre de fluorescence.
Placer un mL de tampon phosphate de 50 millimolaires avec un pH de huit dans une cuvette de quartz à fluorescence d’un mL. Positionnez la cellule dans la chambre thermostatée du spectrophotomètre et réglez la longueur d’onde d’excitation à 295 nanomètres. Enregistrez le spectre de fluorescence.
Le spectre de fluorescence de l’ébauche montre le pic d’eau, qui doit être soustrait plus tard. Obtenir le spectre de fluorescence intrinsèque du domaine N. Placer 900 microlitres de tampon phosphate de 50 millimolaires avec pH 8 dans une cuvette de quartz à fluorescence.
Ajouter 100 microlitres de suspension de domaine N pour obtenir une concentration finale d’un domaine N micromolaire. Homogénéiser doucement à l’aide d’une micropipette pour assurer l’homogénéité de la solution. Positionnez la cellule dans la chambre thermostatée du spectrophotomètre.
Réglez la longueur d’onde d’excitation sur 295 nanomètres. Enregistrez le spectre de fluorescence intrinsèque du domaine N. Ajouter l’ANS et obtenir le spectre de fluorescence par excitation à une longueur d’onde de 295 nanomètres.
Ajouter une aliquote de deux microlitres de solution mère de 100 micromolaires ANS au domaine N en suspension pour obtenir une concentration finale de 0,2 micromolaire ANS. Homogénéiser doucement, à l’aide d’une micropipette pour assurer l’homogénéité de cette solution. Enregistrez le spectre de fluorescence.
Répétez les additions ANS et l’enregistrement spectral de fluorescence comme décrit ci-dessus pour une relation molaire 1:1 ANS N-Domain. Soustrayez le spectre vide de chaque spectre à l’aide d’un logiciel. Tracez tous les spectres dans un seul graphique Déterminez si un motif de type FRET est formé par le spectre.
Les spectres de fluorescence ANS N-Domain forment un motif de type FRET. Titrage de la florescence intrinsèque du domaine N par modification chimique du tryptophane avec NBS. Obtenez à nouveau le spectre de fluorescence intrinsèque du domaine N.
Ajouter une aliquote d’un microlitre d’une solution mère de NBS millimolaire au domaine N en suspension pour obtenir une concentration finale d’un NBS micromolaire. Homogénéiser doucement à l’aide d’une micropipette pour assurer l’homogénéité de la solution. Enregistrez le spectre de fluorescence.
Répétez l’addition NBS et l’enregistrement spectral de fluorescence jusqu’à ce qu’une trempe de fluorescence intrinsèque minimale dans le domaine N soit observée. Homogénéiser doucement à l’aide d’une micropipette pour assurer l’homogénéité de la solution. Soustrayez le spectre vide de chaque spectre à l’aide d’un logiciel.
Tracez tous les spectres dans un seul graphique. Titrer le domaine N modifié par NBS avec ANS en enregistrant des spectres de fluorescence à 25 degrés. Ajouter l’ANS et obtenir le spectre de fluorescence par excitation à une longueur d’onde de 295 nanomètres.
Homogénéiser doucement à l’aide d’une micropipette pour assurer l’homogénéité de la solution. Enregistrez le spectre de fluorescence. Soustrayez le spectre vide de chaque spectre à l’aide d’un logiciel.
Tracez tous les spectres dans un seul graphique. Les spectres de fluorescence générés soutiennent ou réfutent l’apparition de FRET. À savoir que lorsque FRET se produit, la fluorescence ANS n’augmente pas et vice versa.
Preuve de la liaison de l’ANS au domaine N chimiquement modifié par excitation à une longueur d’onde de 370 nanomètres. Ajoutez ANS au domaine N modifié par NBS et enregistrez le spectre de fluorescence intrinsèque du domaine N par excitation à une longueur d’onde de 370 nanomètres. Soustrayez le spectre vide de chaque spectre à l’aide d’un logiciel.
Tracez tous les spectres dans un seul graphique. Confirmer la liaison ANS au domaine N par l’augmentation de l’intensité de fluorescence ANS. La liaison ANS au domaine N montre une augmentation de fluorescence lorsqu’elle est excitée à une longueur d’onde de 370 nanomètres.
Vue d’ensemble des résultats. Le complexe Panel A.ANS N-Domain affiche un motif de type FRET lorsqu’il est excitant à une longueur d’onde de 295 nanomètres. Panel B.NBS éteindre la fluorescence intrinsèque du domaine N en modifiant chimiquement le seul résidu de tryptophane dans le domaine N chimiquement modifié.
Panel C.La fluorescence ANS augmente lorsqu’elle est excitante à une longueur d’onde de 295 nanomètres. Panel D.La fluorescence ANS augmente également lorsqu’elle est excitante à une longueur d’onde de 370 nanomètres. Par conséquent, l’excitation directe de l’ANS à une longueur d’onde de 295 nanomètres est la principale source de fluorescence de l’ANS lorsqu’elle est liée au site de liaison de l’ATP. Conclusions.
Ces essais peuvent être utilisés pour déterminer l’existence de FRET entre les résidus de tryptophane et le SNA dans les protéines. La clarification du FRET, confirmation ou non, entre le tryptophane et le SNA permettra de tirer de meilleures conclusions dans les études structurales protéiques. Le test peut également être utile lors de l’utilisation d’autres fluorophores.
