Diese Assays können helfen, die Rolle von Tryptophan-Rückständen in Proteinen bei der Durchführung von ANS-Bindungsstudien zu klären. Die ANS-Fluoreszenz nimmt bei bindung an bestimmte Strukturstellen in Proteinen zu. Manchmal befindet sich die ANS-Bindungsstelle in der Nähe eines Tryptophan-Rückstands mit einem Abstand, der auf die Existenz von FRET zwischen Tryptophan und ANS hindeutet.
NBS vermittelt die chemische Modifikation von Tryptophanrückständen in Proteinen und löscht deren Fluoreszenz ab. Daher erlauben diese Assays zu bestimmen, ob Tryptophanrückstände zur Erhöhung der ANS-Fluoreszenzintensität durch FRET beitragen. In dieser Arbeit verwenden wir eine entwickelte rekombinante Nukleotidbindungsdomäne aus SERCA, die Mutationen enthält, mit dem Ziel, ein Tryptophan in der Nähe der Nukleotidbindungsstelle zu lokalisieren, an der auch ANS bindet.
Dieser Assay ist schnell und einfach durchzuführen, daher sein Hauptvorteil. Bestimmung der ANS- und SERCA-N-Domänen-Interaktion in silico. Generieren Sie eine dreidimensionale Struktur des Proteins durch molekulare Modellierung mit der bevorzugten Proteinmodellierungssoftware.
Identifizieren Sie die Aminosäurereste, die die Nukleotidbindungsstelle bilden, mit der bevorzugten molekularen Struktursoftware und bestimmen Sie das Vorhandensein von Arginin- und Lysinresten. Diese werden für die ANS-Bindung benötigt und erhöhen die Fluoreszenzintensität. Aufgrund des Vorhandenseins von Arginin- und Lysinresten in der Nukleotidbindungsstelle von SERCA stellen wir die Hypothese auf, dass ANS an die N-Domäne gebunden ist.
Im 3D-Modell werden die Aminosäurereste, die die ATP-Bindungsstelle bilden, identifiziert und orange hervorgehoben. In ähnlicher Weise ist die Tyrosin-zu-Tryptophan-Mutation blau lokalisiert und hervorgehoben. Führen Sie molekulares Andocken mit ATP, FITC und ANS durch.
Die Docking-Ergebnisse zeigen, dass ANS ähnlich wie ATP und FITC gut in die Nukleotidbindungsstelle passt. FITC kennzeichnet die Nukleotidbindungsstelle. Berechnen Sie den molekularen Abstand zwischen dem Tryptophan-Rückstand und ANS.
20 Angström scheint ein angemessener Abstand für FRET zu sein. Führen Sie eine molekulardynamische Simulation des ANS-N-Domänenkomplexes durch, um die Stabilität der Wechselwirkung zu bestimmen. Eine Simulationszeit von 10 Nanosekunden zeigt die Stabilität des Komplexes.
Fahren Sie mit der Durchführung der In-vitro-Experimente fort. Expression und Reinigung der rekombinanten N-Domäne. Drücken und reinigen Sie durch Affinitätschromatographie die entwickelte rekombinante N-Domäne.
Führen Sie eine SDS-PAGE des gereinigten Proteins durch, um die Reinheit zu bestimmen. Bestimmen Sie die Proteinkonzentration durch Absorption bei einer Wellenlänge von 280 Nanometern mit dem N-Domänen-Extinktionskoeffizienten. Überwachen Sie die Bildung des ANS-N-Domänenkomplexes basierend auf ANS- und N-Domänen-Fluoreszenzintensitätsänderungen.
Bereiten Sie eine ANS-Stammlösung in N, N-Dimethylformamid vor. Wiegen Sie eine kleine Menge ANS zwischen einem und fünf Milligramm. ANS in einem ml Endvolumen von N, N-Dimethylformamid auflösen.
Bereiten Sie eine 100 mikromolare ANS-Stammlösung mit der ANS-Lösung in N, N-Dimethylformamid vor. Mischen Sie die Lösung durch Drei- bis Fünffaches. Bereiten Sie die NBS-Stammlösung in N, N-Dimethylformamid vor.
Wiegen Sie eine kleine Menge NBS, ein bis fünf Milligramm. Lösen Sie das NBS in einem ml N,N-Dimethylformamid auf. Bereiten Sie eine ein millimolare NBS-Stammlösung mit der NBS-Lösung in N, N-Dimethylformamid vor.
Mischen Sie die Lösung durch Drei- bis Fünffaches. Titrieren Sie die N-Domäne mit ANS und zeichnen Sie die Fluoreszenzspektren zur Anregung bei einer Wellenlänge von 295 Nanometern bei 25 Grad auf. Erhalten Sie die Ausgangslinie des Fluoreszenzspektrums.
Legen Sie einen ml 50 Millimolarphosphatpuffer mit pH acht in eine ein ml Fluoreszenzquarzküvette. Positionieren Sie die Zelle in der thermostatisierten Zellkammer des Spektralphotometers und stellen Sie die Anregungswellenlänge auf 295 Nanometer ein. Zeichnen Sie das Fluoreszenzspektrum auf.
Das Fluoreszenzspektrum des Rohlings zeigt die Spitze des Wassers, die später subtrahiert werden muss. Erhalten Sie das intrinsische Fluoreszenzspektrum der N-Domäne. 900 Mikroliter 50 Millimolarphosphatpuffer mit pH 8 in eine Fluoreszenzquarzküvette geben.
Fügen Sie 100 Mikroliter N-Domänensuspension hinzu, um eine mikromolare N-Domänen-Endkonzentration zu erhalten. Vorsichtig homogenisieren Sie mit einer Mikropipette, um die Homogenität der Lösung zu gewährleisten. Positionieren Sie die Zelle in der thermostatischen Kammer des Spektralphotometers.
Stellen Sie die Anregungswellenlänge auf 295 Nanometer ein. Zeichnen Sie das intrinsische Fluoreszenzspektrum der N-Domäne auf. Fügen Sie ANS hinzu und erhalten Sie das Fluoreszenzspektrum durch Anregung bei einer Wellenlänge von 295 Nanometern.
Fügen Sie der suspendierten N-Domäne ein Aliquot mit zwei Mikrolitern aus 100 Mikromolaren ANS-Stammlösung hinzu, um eine Endkonzentration von 0,2 Mikromolar ANS zu erhalten. Vorsichtig homogenisieren, indem Sie eine Mikropipette verwenden, um die Homogenität dieser Lösung zu gewährleisten. Zeichnen Sie das Fluoreszenzspektrum auf.
Wiederholen Sie die ANS-Additionen und die Fluoreszenzspektralaufzeichnung wie oben beschrieben für eine 1:1 ANS N-Domänenmolarbeziehung. Subtrahieren Sie das leere Spektrum von jedem Spektrum mithilfe von Software. Zeichnen Sie alle Spektren in einem einzigen Diagramm Bestimmen Sie, ob ein FRET-ähnliches Muster durch das Spektrum gebildet wird.
Die ANS-N-Domain-Fluoreszenzspektren bilden ein FRET-ähnliches Muster. N-Domain intrinsische Floreszenztitration durch Tryptophan-chemische Modifikation mit NBS. Erhalten Sie wieder das intrinsische Fluoreszenzspektrum der N-Domäne.
Fügen Sie der suspendierten N-Domäne ein Aliquot von einem Mikroliter eines Millimolar-NBS-Stammlösung hinzu, um eine Endkonzentration von einem mikromolaren NBS zu erhalten. Vorsichtig homogenisieren Sie mit einer Mikropipette, um die Homogenität der Lösung zu gewährleisten. Zeichnen Sie das Fluoreszenzspektrum auf.
Wiederholen Sie die NBS-Addition und die fluoreszenzspektrale Aufzeichnung, bis eine minimale intrinsische N-Domäne-Fluoreszenzabschreckung beobachtet wird. Vorsichtig homogenisieren Sie mit einer Mikropipette, um die Homogenität der Lösung zu gewährleisten. Subtrahieren Sie das leere Spektrum von jedem Spektrum mithilfe von Software.
Zeichnen Sie alle Spektren in einem einzigen Diagramm auf. Titrieren Sie die NBS-modifizierte N-Domäne mit ANS, indem Sie Fluoreszenzspektren bei 25 Grad aufzeichnen. Fügen Sie ANS hinzu und erhalten Sie das Fluoreszenzspektrum durch Anregung bei einer Wellenlänge von 295 Nanometern.
Vorsichtig homogenisieren Sie mit einer Mikropipette, um die Homogenität der Lösung zu gewährleisten. Zeichnen Sie das Fluoreszenzspektrum auf. Subtrahieren Sie das leere Spektrum von jedem Spektrum mithilfe von Software.
Zeichnen Sie alle Spektren in einem einzigen Diagramm auf. Die erzeugten Fluoreszenzspektren unterstützen oder widerlegen das Auftreten von FRET. Wenn nämlich FRET auftritt, nimmt die ANS-Fluoreszenz nicht zu und umgekehrt.
Nachweis einer ANS-Bindung an die chemisch modifizierte N-Domäne durch Anregung bei einer Wellenlänge von 370 Nanometern. Fügen Sie der NBS-modifizierten N-Domäne ANS hinzu und zeichnen Sie das intrinsische Fluoreszenzspektrum der N-Domäne durch Anregung bei einer Wellenlänge von 370 Nanometern auf. Subtrahieren Sie das leere Spektrum von jedem Spektrum mithilfe von Software.
Zeichnen Sie alle Spektren in einem einzigen Diagramm auf. Bestätigen Sie die ANS-Bindung an die N-Domäne durch die zunehmende ANS-Fluoreszenzintensität. Die ANS-Bindung an die N-Domäne zeigt eine Fluoreszenzerhöhung, wenn sie bei einer Wellenlänge von 370 Nanometern angeregt wird.
Ergebnisübersicht. Panel A.ANS N-Domain Komplex zeigt ein FRET-ähnliches Muster, wenn es bei einer Wellenlänge von 295 Nanometern anregen wird. Panel B.NBS löscht die intrinsische Fluoreszenz der N-Domäne durch chemische Modifikation des einzigen Tryptophan-Rückstands in der chemisch modifizierten N-Domäne.
Panel C.Die ANS-Fluoreszenz nimmt zu, wenn sie bei einer Wellenlänge von 295 Nanometern anregen. Panel D.Die ANS-Fluoreszenz nimmt auch bei Einer Anregen bei einer Wellenlänge von 370 Nanometern zu. Daher ist die direkte Anregung von ANS bei einer Wellenlänge von 295 Nanometern die Hauptquelle der ANS-Fluoreszenz, wenn sie an die ATP-Bindungsstelle gebunden ist. Schlüsse.
Diese Assays können verwendet werden, um das Vorhandensein von FRET zwischen Tryptophanrückständen und ANS in Proteinen zu bestimmen. Die Abklärung von FRET, Bestätigung oder nicht, zwischen Tryptophan und ANS wird es ermöglichen, bessere Schlussfolgerungen in Proteinstrukturstudien zu ziehen. Der Assay kann auch bei der Verwendung anderer Fluorophore nützlich sein.
