이러한 분석안스 결합 연구를 수행할 때 단백질의 트립토판 잔류물의 역할을 명확히 하는 데 도움이 될 수 있습니다. ANS 형광은 단백질의 특정 구조 부위에 결합하면 증가합니다. 때로는 ANS 바인딩 사이트는 트립토판과 ANS 사이에 FRET의 존재를 암시하는 거리가있는 트립토판 잔류물 가까이를 찾습니다.
NBS는 단백질의 트립토판 잔류물의 화학적 변형을 중재하여 형광을 담금질합니다. 따라서, 이러한 분석체는 트립토판 잔류물이 FRET에 의한 ANS 형광 강도의 증가에 기여하는지 여부를 결정할 수 있게 한다. 이 작품에서, 우리는 ANS가 또한 결합하는 뉴클레오티드 결합 부위에 가까운 트립토판을 찾는 것을 목표로, 돌연변이를 포함하는 SERCA에서 엔지니어링 된 재조합 뉴클레오티드 결합 도메인을 사용합니다.
이 분석은 빠르고 수행하기 쉽기 때문에 주요 이점입니다. ANS 및 SERCA N-도메인 상호 작용의 실리코에서의 결정. 바람직한 단백질 모델링 소프트웨어를 사용하여 분자 모델링을 통해 단백질의 3차원 구조를 생성한다.
바람직한 분자 구조 소프트웨어를 사용하여 뉴클레오티드 결합 부위를 형성하는 아미노산 잔류물을 식별하고 아르기닌 및 리신 잔류물의 존재를 결정한다. 이들은 ANS 결합을 위해 요구되고 형광 강도를 증가시다. SERCA의 뉴클레오티드 결합 부위에 아르기닌 및 리신 잔류물이 존재하기 때문에 ANS의 결합을 N-도메인에 가설화합니다.
3D 모델에서 ATP 결합 부위를 형성하는 아미노산 잔기는 주황색으로 식별되고 강조표시됩니다. 마찬가지로, 티로신-트립토판 돌연변이는 파란색으로 위치하고 강조 표시됩니다. ATP, FITC 및 ANS로 분자 도킹을 수행합니다.
도킹 결과는 ANS가 ATP 및 FITC와 유사하게 뉴클레오티드 결합 부위에 잘 맞는다는 것을 보여줍니다. FITC는 뉴클레오티드 결합 부위를 라벨. 트립토판 잔류물과 ANS 사이의 분자 거리를 계산합니다.
20 개의 협질은 FRET에 적합한 거리인 것 같습니다. ANS N-도메인 컴플렉스의 분자 동적 시뮬레이션을 수행하여 상호 작용의 안정성을 결정합니다. 10나노초 시뮬레이션 시간은 복합체의 안정성을 보여줍니다.
시험관 내 실험을 수행합니다. 재조합 N-도메인의 발현 및 정제. 호화질 크로마토그래피에 의해, 엔지니어링 재조합 N-도메인에 의해, 익스프레스 및 정화.
순도를 결정하기 위해 정제된 단백질의 SDS-PAGE를 수행한다. N-도메인 소멸 계수로 280 나노미터의 파장에서 흡광도에 의한 단백질 농도를 결정한다. ANS 및 N-도메인 형광 강도 변화에 따라 ANS N-도메인 복합체의 형성을 모니터링합니다.
N-디메틸포르마미드에서 ANS 스톡 솔루션을 준비하세요. 소량의 ANS의 무게, 사이 1 받는 사람 5 밀리 그램. N, N-디메틸포르마미드의 최종 부피의 한 mL에 ANS를 용해하십시오.
N-디메틸포르마미드의 ANS 솔루션을 사용하여 100마이크로몰라 ANS 스톡 솔루션을 준비합니다. 3~5회 소용돌이로 용액을 섞는다. N-디메틸포르마미드N에서 NBS 재고 솔루션을 준비하십시오.
소량의 NBS의 무게, 1 ~ 5 밀리 그램. N-디메틸포르마미드의 1mL에 NBS를 녹입니다. N-디메틸포르마미드N의 NBS 솔루션을 사용하여 1밀리머 NBS 스톡 솔루션을 준비합니다.
3~5회 소용돌이로 용액을 섞는다. ANS로 N-도메인을 적시하고 25도에서 295 나노미터의 파장에서 흥분 스펙트럼을 기록합니다. 형광 스펙트럼 기준선을 가져옵니다.
1mL 형광 석영 큐벳에 pH 8로 50 밀리머 인산염 버퍼 1mL를 놓습니다. 분광계의 열성 세포 챔버에 세포를 배치하고 295 나노미터에 흥분 파장을 설정합니다. 형광 스펙트럼을 기록합니다.
빈의 형광 스펙트럼은 나중에 빼야하는 물의 피크를 보여줍니다. N-도메인의 본질적인 형광 스펙트럼을 가져옵니다. 형광 석영 큐벳에 pH 8과 50 밀리머 인산염 버퍼의 900 마이크로 리터를 배치합니다.
100 마이크로리터의 N-도메인 서스펜션을 추가하여 하나의 마이크로몰러 N-도메인 최종 농도를 생성합니다. 마이크로파이프를 사용하여 부드럽게 균질화하여 용액의 균질성을 보장합니다. 분광계의 열성 챔버에 셀을 배치합니다.
295 나노미터로 여기 파장을 설정합니다. N-도메인 내재형 형광 스펙트럼을 기록합니다. ANS를 추가하고 295 나노미터의 파장에서 흥분하여 형광 스펙트럼을 얻습니다.
정지된 N-도메인에 100 마이크로몰러 ANS 스톡 솔루션의 2개의 마이크로리터 알리쿼트를 추가하여 0.2 마이크로몰라 ANS 최종 농도를 얻습니다. 이 솔루션의 균질성을 보장하기 위해 마이크로 파이프를 사용하여 부드럽게 균질화하십시오. 형광 스펙트럼을 기록합니다.
1:1 ANS N-도메인 어어 관계에 대해 위에서 설명한 대로 ANS 추가 및 형광 스펙트럼 기록을 반복합니다. 소프트웨어를 사용하여 각 스펙트럼에서 빈 스펙트럼을 뺍니다. 단일 그래프에서 모든 스펙트럼을 플롯하면 FRET 와 같은 패턴이 스펙트럼에 의해 형성되는지 여부를 결정합니다.
ANS N-도메인 형광 스펙트럼은 FRET와 같은 패턴을 형성합니다. N-도메인 내재 된 플로레시션 Titration 에 의해 트립토판 화학 수정 NBS. N-도메인의 본질적인 형광 스펙트럼을 다시 가져옵니다.
1개의 마이크로몰러 NBS 스톡 솔루션의 1개의 마이크로리터 알리쿼트를 일시 중단된 N-도메인에 추가하여 하나의 마이크로몰러 NBS의 최종 농도를 얻습니다. 마이크로파이프를 사용하여 부드럽게 균질화하여 용액의 균질성을 보장합니다. 형광 스펙트럼을 기록합니다.
최소한의 N-Domain 내재형 형광 담금질이 관찰될 때까지 NBS 첨가 및 형광 스펙트럼 레코딩을 반복한다. 마이크로파이프를 사용하여 부드럽게 균질화하여 용액의 균질성을 보장합니다. 소프트웨어를 사용하여 각 스펙트럼에서 빈 스펙트럼을 뺍니다.
단일 그래프에서 모든 스펙트럼을 플롯합니다. NBS는 25도에서 형광 스펙트럼을 기록하여 ANS로 N-도메인을 수정했습니다. ANS를 추가하고 295 나노미터의 파장에서 흥분하여 형광 스펙트럼을 얻습니다.
마이크로파이프를 사용하여 부드럽게 균질화하여 용액의 균질성을 보장합니다. 형광 스펙트럼을 기록합니다. 소프트웨어를 사용하여 각 스펙트럼에서 빈 스펙트럼을 뺍니다.
단일 그래프에서 모든 스펙트럼을 플롯합니다. 생성된 형광 스펙트럼은 FRET의 발생을 지원하거나 반박한다. 즉 FRET가 발생하면 ANS 형광이 증가하지 않으며 그 반대의 경우도 마찬가지입니다.
370 나노미터의 파장에서 여기에 의해 화학적으로 변형 된 N-도메인에 결합ANS의 증거. NBS 수정된 N-도메인에 ANS를 추가하고 370 나노미터의 파장에서 여기로 N-도메인 내재형 형광 스펙트럼을 기록합니다. 소프트웨어를 사용하여 각 스펙트럼에서 빈 스펙트럼을 뺍니다.
단일 그래프에서 모든 스펙트럼을 플롯합니다. 증가하는 ANS 형광 강도에 의해 N 도메인에 바인딩ANS 바인딩을 확인합니다. N-도메인에 결합하는 ANS는 370 나노미터의 파장에서 흥분할 때 형광 증가를 나타낸다.
결과 개요입니다. 패널 A.ANS N-도메인 복합체는 295 나노미터의 파장에서 흥미진진할 때 FRET와 같은 패턴을 표시합니다. 패널 B.NBS는 화학적으로 변형된 N-Domain에서 유일한 트립토판 잔류물을 화학적으로 수정하여 N-Domain 본질형 형광을 담금질합니다.
패널 C.ANS 형광은 295 나노미터의 파장에서 흥미진진할 때 증가합니다. 패널 D.ANS 형광은 370 나노미터의 파장에서 흥미진진할 때 증가합니다. 따라서, 295 나노미터의 파장에서 ANS의 직접 발동은 ATP 결합 부위에 바인딩될 때 ANS 형광의 주요 원천이다. 결론.
이러한 분석체는 단백질에서 트립토판 잔류물과 ANS 사이의 FRET의 존재를 결정하는 데 사용될 수 있다. 트립토판과 ANS 사이의 FRET, 확인 여부의 설명은 단백질 구조 연구에서 더 나은 결론을 도출 할 수 있습니다. 분석은 또한 다른 형광을 사용하는 경우에 유용할 수 있습니다.
