Эти анализы могут помочь прояснить роль остатков триптофана в белках при проведении исследований связывания ВСС. Флуоресценция ВСС увеличивается при связывании с определенными структурными сайтами в белках. Иногда место связывания ВАНС находится близко к остатку триптофана с расстоянием, которое предполагает существование FRET между триптофаном и ANS.
NBS опосредует химическую модификацию остатков триптофана в белках, гася его флуоресценцию. Таким образом, эти анализы позволяют определить, способствуют ли остатки триптофана увеличению интенсивности флуоресценции ВАНС при ФРЭ. В этой работе мы используем инженерный рекомбинантный нуклеотидный связывающий домен из SERCA, содержащий мутации, с целью найти триптофан близко к месту связывания нуклеотидов, где также связывается ANS.
Этот анализ является быстрым и простым в выполнении, отсюда и его главное преимущество. Определение in silico взаимодействия ANS и SERCA N-Domain. Генерация трехмерной структуры белка путем молекулярного моделирования с использованием предпочтительного программного обеспечения для моделирования белка.
Идентифицировать аминокислотные остатки, которые образуют сайт связывания нуклеотидов, используя предпочтительное молекулярно-структурное программное обеспечение, и определить наличие остатков аргинина и лизина. Они необходимы для связывания ВСС и увеличения интенсивности флуоресценции. Из-за присутствия остатков аргинина и лизина в нуклеотидном сайте связывания SERCA мы предполагаем связывание ВНС с N-доменом.
В 3D-модели аминокислотные остатки, образующие сайт связывания АТФ, идентифицируются и выделяются оранжевым цветом. Аналогичным образом, мутация тирозина в триптофан расположена и выделена синим цветом. Выполните молекулярную стыковку с АТФ, ФИТЦ и ВАНС.
Результаты стыковки показывают, что ВАНС хорошо вписывается в сайт связывания нуклеотидов, аналогично АТФ и ФИТЦ. FITC маркирует сайт связывания нуклеотидов. Рассчитайте молекулярное расстояние между остатком триптофана и ВАНС.
20 ангстрем кажутся подходящим расстоянием для FRET. Выполнить молекулярно-динамическое моделирование комплекса ANS N-Domain для определения стабильности взаимодействия. Время моделирования в 10 наносекунд показывает стабильность комплекса.
Приступайте к выполнению экспериментов in vitro. Экспрессия и очистка рекомбинантного N-домена. Экспрессируют и очищают с помощью аффинной хроматографии инженерный рекомбинантный N-домен.
Выполните SDS-PAGE очищенного белка для определения чистоты. Определяют концентрацию белка по поглощению на длине волны 280 нанометров с коэффициентом вымирания N-домена. Мониторинг формирования комплекса ANS N-Domain на основе изменений интенсивности флуоресценции ANS и N-domain.
Готовят раствор ВНС в N, N-диметилформамиде. Взвесьте небольшое количество ВСС, от одного до пяти миллиграммов. Растворяют ВНС в одном мл конечного объема N, N-диметилформамида.
Готовят 100-микромолярный раствор ANS с использованием раствора ANS в N, N-диметилформамиде. Перемешайте раствор, вихрев три-пять раз. Готовят раствор NBS в N, N-диметилформамиде.
Взвесьте небольшое количество NBS, от одного до пяти миллиграммов. Растворяют NBS в одном мл N, N-диметилформамида. Готовят один миллимолярный раствор NBS, используя раствор NBS в N, N-диметилформамиде.
Перемешайте раствор, вихрев три-пять раз. Титруйте N-домен с ANS и запишите спектры флуоресценции для возбуждения на длине волны 295 нанометров при 25 градусах. Получение базового уровня флуоресцентного спектра.
Поместите один мл 50-миллимолярного фосфатного буфера с рН восемь в одну мл флуоресцентную кварцевую кювету. Поместите ячейку в термостатированную камеру ячейки спектрофотометра и установите длину волны возбуждения на 295 нанометров. Запишите спектр флуоресценции.
Спектр флуоресценции заготовки показывает пик воды, который должен быть вычтен позже. Получение собственного флуоресцентного спектра N-домена. Поместите 900 микролитров 50-миллимолярного фосфатного буфера с рН 8 в флуоресцентную кварцевую кювету.
Добавьте 100 микролитров n-доменной суспензии, чтобы получить одну микромолярный конечную концентрацию N-домена. Аккуратно гомогенизируйте с помощью микропипетки, чтобы обеспечить однородность раствора. Поместите ячейку в термостатированную камеру спектрофотометра.
Установите длину волны возбуждения на 295 нанометров. Запишите спектр внутренней флуоресценции N-домена. Добавьте ВНС и получите спектр флуоресценции путем возбуждения на длине волны 295 нанометров.
Добавьте два микролитра аликвоты 100 микромолярной стоковой раствора ANS к взвешенному N-домену для получения конечной концентрации 0,2 микромолярной ANS. Аккуратно гомогенизировать, используя микропипетку для обеспечения однородности этого раствора. Запишите спектр флуоресценции.
Повторите дополнения ANS и флуоресцентную спектральную запись, как описано выше, для молярного отношения 1:1 ANS N-Domain. Вычтите пустой спектр из каждого спектра с помощью программного обеспечения. Построение всех спектров в одном графе Определите, образуется ли спектром FRET-подобный паттерн.
Спектры флуоресценции ANS N-домена образуют FRET-подобный паттерн. N-доменное титрование внутренней флорикулесии путем химической модификации триптофана с NBS. Снова получите внутренний спектр флуоресценции N-домена.
Добавьте один микролитр аликвоты одного раствора миллимолярного NBS к взвешенному N-домену для получения конечной концентрации одного микромоляра NBS. Аккуратно гомогенизируйте с помощью микропипетки, чтобы обеспечить однородность раствора. Запишите спектр флуоресценции.
Повторяйте спектральную запись сложения и флуоресценции NBS до тех пор, пока не будет наблюдаться минимальное закалка внутренней флуоресценции N-домена. Аккуратно гомогенизируйте с помощью микропипетки, чтобы обеспечить однородность раствора. Вычтите пустой спектр из каждого спектра с помощью программного обеспечения.
Построй все спектры в одном графике. Титруем модифицированный N-домен NBS с помощью ANS, регистрируя спектры флуоресценции под 25 градусов. Добавьте ВНС и получите спектр флуоресценции путем возбуждения на длине волны 295 нанометров.
Аккуратно гомогенизируйте с помощью микропипетки, чтобы обеспечить однородность раствора. Запишите спектр флуоресценции. Вычтите пустой спектр из каждого спектра с помощью программного обеспечения.
Построй все спектры в одном графике. Генерируемые флуоресцентные спектры поддерживают или опровергают возникновение FRET. А именно, когда происходит FRET, флуоресценция ANS не увеличивается и наоборот.
Доказательства связывания ВНС с химически модифицированным N-доменом путем возбуждения на длине волны 370 нанометров. Добавьте ANS к модифицированной N-домену NBS и запишите спектр внутренней флуоресценции N-домена путем возбуждения на длине волны 370 нанометров. Вычтите пустой спектр из каждого спектра с помощью программного обеспечения.
Построй все спектры в одном графике. Подтвердите связывание ANS с N-доменом увеличением интенсивности флуоресценции ANS. Связывание ANS с N-доменом показывает увеличение флуоресценции при возбуждении на длине волны 370 нанометров.
Обзор результатов. Панель A.ANS N-Domain комплекса отображает FRET-подобный рисунок при возбуждении на длине волны 295 нанометров. Панель B.NBS гашит внутреннюю флуоресценцию N-домена путем химической модификации единственного остатка триптофана в химически модифицированном N-домене.
Панель C.Флуоресценция ANS увеличивается при возбуждении на длине волны 295 нанометров. Флуоресценция ANS также увеличивается при возбуждении на длине волны 370 нанометров. Поэтому прямое возбуждение ВНС на длине волны 295 нанометров является основным источником флуоресценции ВНС, когда она связана с сайтом связывания АТФ. Выводы.
Эти анализы могут быть использованы для определения существования FRET между остатками триптофана и ANS в белках. Уточнение FRET, подтверждение или нет, между триптофаном и ВАНС позволит сделать лучшие выводы в структурных исследованиях белка. Анализ также может быть полезен при использовании других флуорофоров.
