تلعب التفاعلات الانتقالية المشتركة دورا حاسما في تعديلات السلسلة الناشئة التي تستهدف مسارات الطي والتجميع. هنا ، نصف التنميط الريبوسومي الانتقائي ، وهي طريقة للتحليل المباشر في الجسم الحي لهذه التفاعلات في نموذج حقيقيات النوى Saccaromyces cerevisiae. التنميط الريبوسومي الانتقائي هو الطريقة الوحيدة حتى الآن التي تلتقط وتميز التفاعلات الانتقالية المشتركة في الجسم الحي بطريقة مباشرة.
يتيح التنميط الانتقائي للريبوسوم التنميط العالمي لأي عوامل وتفاعلات مع ترجمة الريبوسومات بدقة قريبة من الكودون. ابدأ بجمع خلايا الخميرة المبنية التي تحتوي على البروتينات الموسومة المطلوبة. قم بإجراء تحلل الخلايا باستخدام الطحن المبرد في مطحنة الخلاط مرتين لمدة دقيقتين عند 30 هرتز.
جهاز طرد مركزي لمدة دقيقتين عند 30،000 مرة G عند أربع درجات مئوية لمسح الليزات ، وجمع supernatant. نقل 200 ميكرولتر من السوبرنات إلى أنبوب جهاز طرد مركزي دقيق لتحليل الحمض النووي الريبي الكلي و 700 ميكرولتر إلى أنبوب جهاز طرد مركزي دقيق لتنقية المناعة. هضم عينة الحمض النووي الريبي الكلي المنفصلة سابقا باستخدام 10 وحدات من RNase I لمدة 25 دقيقة عند أربع درجات مئوية على رف خلط دوار عند 30 دورة في الدقيقة.
تحضير المزيج الرئيسي لوسادة السكروز كما هو موضح في مخطوطة النص. ثم قم بتحميل العينة على 400 ميكرولتر من وسادة السكروز وأجهزة الطرد المركزي لمدة 90 دقيقة عند 245،000 مرة من G وعند أربع درجات مئوية. قم بإزالة السوبرناتانت بسرعة باستخدام مضخة تفريغ وكريات تراكب مع 150 ميكرولتر من المخزن المؤقت للتحليل.
قم بتأمين العينة باستخدام غلاف البارافين وأعد تعليق الكريات عن طريق الاهتزاز لمدة ساعة واحدة عند أربع درجات مئوية عند 300 دورة في الدقيقة. اغسل 100 إلى 400 ميكرولتر من مصفوفة ربط التقارب لكل عينة ثلاث مرات باستخدام ملليلتر واحد من المخزن المؤقت للتحلل عن طريق تعليق مصفوفة التقارب في مخزن التحلل المؤقت. ثم ، قم بالتدوير بمعدل 30 دورة في الدقيقة باستخدام رف خلط دوار عند أربع درجات مئوية لمدة خمس دقائق.
ترسب عن طريق الطرد المركزي. تخلص من السائل العلوي وكرر هذه العملية ثلاث مرات. أضف مصفوفة ربط التقارب إلى عينة التنقية المناعية المنفصلة سابقا وهضمها باستخدام RNase I.Rotate لمدة 25 دقيقة بمعدل 30 دورة في الدقيقة وأربع درجات مئوية مع رف خلط دوار لربط البروتين بمصفوفة التقارب.
قم بإعداد المزيج الرئيسي للمخزن المؤقت للغسيل كما هو موضح في مخطوطة النص. اغسل مصفوفة ربط التقارب بملليلتر واحد من المخزن المؤقت للغسيل لمدة دقيقة واحدة تقريبا ، مع الدوران في رف المزيج. بعد ذلك ، ترسب عن طريق الطرد المركزي عند 3000 مرة G لمدة 30 ثانية عند أربع درجات مئوية وتخلص من السائل العلوي.
كرر ثلاث مرات. اغسل مرتين أخريين في ملليلتر واحد من المخزن المؤقت للغسيل ، في كل مرة لمدة خمس دقائق ، مع الدوران في رف المزيج. ترسب مرة أخرى عن طريق الطرد المركزي.
استخدم 50 ميكرولتر من الخرز لتخليص البروتين بنفس الكمية من المخزن المؤقت لعينة 2X. جهاز طرد مركزي لتكوير الخرز والتخلص من السائل العلوي. Elute مع 700 ميكرولتر من 10 ملليمولار تريس.
ثم ، تجميد في النيتروجين السائل. قم بإزالة العينة من النيتروجين السائل وتخزينها عند 80 درجة مئوية تحت الصفر لاستخدامها في استخراج الحمض النووي الريبي اللاحق. قم بتقييم نجاح خطوة تنقية التقارب عن طريق تلطيخ اللطخة الغربية أو تلطيخ Coomassie مع الاقتباسات من كل خطوة باستخدام IP وهمي على سلالة من النوع البري غير الموسومة كعنصر تحكم للربط غير المحدد بمصفوفة التقارب.
أظهرت نتائج اللطخة الغربية بعد تنقية التقارب نجاح تعبير البروتين المعلم. تم التحقق من عزل آثار الأقدام المحمية من الريبوسوم باستخدام النتائج من المحلل الحيوي. أثناء إنشاء مكتبة cDNA للتسلسل العميق وتحليل البيانات الضخمة ، يؤدي نقص التدوير إلى انخفاض الغلة.
ومع ذلك ، مع بقاء dNTPs موجودة ، يستمر التفاعل ، مما يولد قطعا أثرية أطول من PCR مع تسلسلات وهمية بسبب منتجات PCR التي تستعد لنفسها. تم التحقق من صحة المكتبة التي تم إنشاؤها بواسطة الرحلان الكهربائي للحمض النووي عالي الحساسية لتوزيع الحجم الدقيق وتحديد الكمية. تم اقتطاع مكتبة التسلسل للمحولات والباركود وتم تقسيم القراءات الناتجة إلى مجموعات مختلفة من تسلسلات الترميز والإنترونات والتسلسلات بين الجينات.
يتم عرض ملفات تعريف الريبوسوم التي تحلل التفاعلات الانتقالية المشتركة ل Vma2p مع المرافقة المرتبطة بالريبوسوم Ssb1p و Pfk2p و Fas1p هنا مع المخطط التجريبي لكل تنقية تقارب. كان هناك إشغال الريبوسوم على طول إطار القراءة المفتوح للتراناتومات الكلية مقارنة ب Ssb1 و Pfk2p و Fas1p interactomes. يظهر هنا متوسط إثراء Ssb1p و Pfk2p و Fas1p في كل موضع ريبوسوم على طول إطار القراءة المفتوح.
تمكن هذه الطريقة من تحديد وتوصيف مختلف التفاعلات الانتقالية المشتركة ، مما يضمن وجود بروتين وظيفي ، بالإضافة إلى دراسة الأمراض المختلفة. حتى الآن ، يعد التنميط الريبوسومي الانتقائي هو الطريقة الوحيدة التي يمكنها التقاط هذه التفاعلات وتوصيفها بطريقة مباشرة في الجسم الحي.
