共翻訳相互作用は、折り畳みおよび集合経路を標的とする新生鎖修飾において重要な役割を果たします。ここで、選択的リボソームプロファイリング、モデル真核生物サッカロミセス・セレビシエにおけるこれらの相互作用のin vivo直接分析のための方法について説明する。選択的リボソームプロファイリングは、インビボでの共翻訳相互作用を直接的に捕捉し、特徴付ける唯一の方法です。
選択的リボソームプロファイリングは、任意の因子のグローバルプロファイリングを可能にし、リボソームをほぼコドン分解能で翻訳することとの相互作用を可能にする。所望のタグ付きタンパク質を含む構築された酵母細胞を収集することから始める。ミキサーミル中で極低温粉砕を用いて細胞溶解を30ヘルツで2分間2回行う。
4°Cで30,000倍Gで2分間遠心分離し、溶解液を清澄し、上清を回収した。上清200マイクロリットルをトータルRNA分析用の微量遠心チューブに、700マイクロリットルを免疫精製用の微量遠心チューブに移す。以前に分離した全RNAサンプルを、10単位のRNase Iを用いて、毎分30回転で回転するミキシングラック上で摂氏4度で25分間消化する。
テキスト原稿に記載されているようにスクロースクッションマスターミックスを準備します。次いで、試料を400マイクロリットルのスクロースクッションに積み込み、245,000倍Gおよび摂氏4度で90分間遠心分離する。真空ポンプで上清をすばやく取り除き、ペレットに150マイクロリットルの溶解バッファーを重ねます。
サンプルをパラフィンラップで固定し、毎分300回転で摂氏4度で1時間振ってペレットを再懸濁します。アフィニティーマトリックスを溶解バッファーに再懸濁することによって、サンプル当たり100〜400マイクロリットルのアフィニティー結合マトリックスを1ミリリットルの溶解バッファーで3回洗浄する。その後、4°Cの回転ミキシングラックで5分間、毎分30回転で回転します。
遠心分離により沈殿させる。上の液体を捨て、このプロセスを3回繰り返します。以前に分離した免疫精製サンプルにアフィニティー結合マトリックスを追加し、RNase I.Rotateを使用して、回転ミキシングラックで毎分30回転、摂氏4度で25分間消化し、タンパク質をアフィニティーマトリックスに結合させます。
テキスト原稿の説明に従って洗浄バッファーマスターミックスを準備します。アフィニティー結合マトリックスを1ミリリットルの洗浄バッファーで約1分間洗浄し、ミックスラック内で回転させます。次に、3000倍Gで4°Cで30秒間遠心分離して沈殿させ、上液を捨てた。
これを3回繰り返します。1ミリリットルの洗浄バッファーでさらに2回、毎回5分間、ミックスラック内で回転させます。遠心分離により再度沈殿させる。
同じ量の2倍サンプルバッファーでタンパク質溶出に50マイクロリットルのビーズを使用してください。遠心分離機でビーズをペレット化し、上部の液体を捨てる。700マイクロリットルの10ミリモルトリスで溶出する。
その後、液体窒素中で凍結する。液体窒素からサンプルを取り出し、その後のRNA抽出に使用するために摂氏マイナス80度で保存します。アフィニティーマトリックスへの非特異的結合の対照として、タグなしの野生型株上でのモックIPを用いた各ステップのアリコートによるウェスタンブロットまたはクーマシー染色によるアフィニティー精製ステップの成功を評価する。
アフィニティー精製後のウェスタンブロット結果は、タグ付きタンパク質発現の成功を実証した。リボソームで保護されたフットプリントの単離は、バイオアナライザーからの結果を用いて検証した。ディープシーケンシングとビッグデータ解析のためのcDNAライブラリを生成する一方で、アンダーサイクルは低収率につながります。
しかし、dNTPsがまだ存在すると、反応は進行し、PCR産物がそれ自体をプライミングするためにキメラ配列を有するより長いPCRアーティファクトを生成する。生成されたライブラリーを、正確なサイズ分布および定量のために高感度DNA電気泳動によってさらに検証した。配列ライブラリをアダプタとバーコード用にトリミングし、結果として得られた読み取りを、コード配列、イントロン、および遺伝子間配列の異なるグループに分割しました。
Vma2pとリボソーム関連シャペロンSsb1p、Pfk2p、およびFas1pとの共翻訳相互作用を分析するリボソームプロファイルを、各アフィニティー精製の実験スキームとともにここに示す。Ssb1、Pfk2p、およびFas1pインターアクトームと比較して、全翻訳体の開いた読書フレームに沿ってリボソーム占有率があった。開いたリーディングフレームに沿った各リボソーム位置におけるSsb1p、Pfk2p、およびFas1pの平均濃縮度がここに示されている。
この方法は、様々な共翻訳相互作用の同定および特性評価を可能にし、機能的プロテオームを確実にし、ならびに様々な疾患の研究を可能にする。今日まで、選択的リボソームプロファイリングは、これらの相互作用をインビボで直接的に捕捉し、特徴付けることができる唯一の方法である。
