Котрансляционные взаимодействия играют решающую роль в зарождающихся модификациях цепи, нацеленных на пути складывания и сборки. Здесь мы описываем селективное профилирование рибосом, метод прямого анализа in vivo этих взаимодействий в модели eukaryote Saccaromyces cerevisiae. Селективное профилирование рибосом является единственным методом на сегодняшний день, который непосредственно фиксирует и характеризует котрансляционные взаимодействия in vivo.
Селективное профилирование рибосом позволяет глобально профилировать любые факторы и взаимодействия с трансляцией рибосом в почти кодонном разрешении. Начните со сбора построенных дрожжевых клеток, содержащих желаемые помеченные белки. Выполняют лизис клеток с использованием криогенного измельчения в смесительной мельнице дважды в течение двух минут при 30 Гц.
Центрифугируйте в течение двух минут при 30 000 G при четырех градусах Цельсия, чтобы очистить лизат и собрать супернатант. Перенесите 200 микролитров супернатанта в микроцентрифужную трубку для общего анализа РНК и 700 микролитров в микроцентрифужную трубку для иммуноочистки. Переварите ранее разделенный общий образец РНК, используя 10 единиц РНКазы I в течение 25 минут при четырех градусах Цельсия на вращающейся смесительной стойке со скоростью 30 оборотов в минуту.
Подготовьте мастер-микс сахарозной подушки, как описано в тексте рукописи. Затем загрузите образец на 400 микролитров сахарозной подушки и центрифуги в течение 90 минут при 245 000 G и при четырех градусах Цельсия. Быстро удалите супернатант с помощью вакуумного насоса и наложите гранулы на 150 микролитров лизисного буфера.
Закрепите образец парафиновой пленкой и повторно суспендируйте гранулы, встряхивая в течение одного часа при четырех градусах Цельсия со скоростью 300 оборотов в минуту. Промывайте от 100 до 400 микролитров матрицы аффинного связывания на образец три раза с помощью одного миллилитра лизисного буфера путем повторного использования матрицы аффинности в буфере лизиса. Затем вращайте со скоростью 30 оборотов в минуту с помощью вращающейся смесительной стойки при четырех градусах Цельсия в течение пяти минут.
Осадок путем центрифугирования. Отбросьте верхнюю жидкость и повторите этот процесс три раза. Добавьте аффинную связывающую матрицу к ранее отделенному образцу иммуноочистки и переварите его с помощью РНКазы I. Вращайте в течение 25 минут со скоростью 30 оборотов в минуту и четыре градуса Цельсия с помощью вращающейся смесительной стойки для связывания белка с матрицей аффинности.
Подготовьте мастер-микс буфера для стирки, как описано в тексте рукописи. Промывайте матрицу аффинного связывания одним миллилитром буфера для стирки в течение примерно одной минуты, вращаясь в стойке для смешивания. Затем выбрасывают в осадок центрифугированием при 3000 G в течение 30 секунд при четырех градусах Цельсия и отбрасывают верхнюю жидкость.
Повторите три раза. Мойте еще два раза в одном миллилитре моечного буфера, каждый раз в течение пяти минут, вращаясь в стойке для смешивания. Снова выпадает в осадок путем центрифугирования.
Используйте 50 микролитров бусин для элюирования белка с таким же количеством буфера образца 2X. Центрифуга гранулирует бусины и выбрасывает верхнюю жидкость. Элют с 700 микролитрами 10-миллимолярного триса.
Затем заморозить в жидком азоте. Извлеките образец из жидкого азота и храните при минус 80 градусах Цельсия для последующей экстракции РНК. Оцените успешность этапа очистки аффинности путем окрашивания вестерн-блот или Кумасси аликвотами каждого шага, используя макет IP на немеченом штамме дикого типа в качестве элемента управления для неспецифического связывания с матрицей аффинности.
Результаты вестерн-блоттинга после аффинной очистки продемонстрировали успех меченой экспрессии белка. Выделение следов, защищенных рибосомами, было подтверждено с использованием результатов биоанализатора. При создании библиотеки кДНК для глубокого секвенирования и анализа больших данных недостаточная цикличность приводит к низкой доходности.
Однако, когда dNTP все еще присутствуют, реакция продолжается, генерируя более длинные артефакты ПЦР с химерными последовательностями из-за того, что продукты ПЦР грунтуют себя. Сгенерированная библиотека была дополнительно подтверждена высокочувствительным электрофорезом ДНК для точного распределения размеров и количественной оценки. Библиотека последовательностей была обрезана для адаптеров и штрих-кодов, и полученные считывания были разделены на различные группы кодирующих последовательностей, интронов и интергенных последовательностей.
Здесь показаны рибосомные профили, анализирующие котрансляционные взаимодействия Vma2p с рибосомно-ассоциированным шапероном Ssb1p, Pfk2p и Fas1p с экспериментальной схемой очистки каждого аффинности. Наблюдалось заполнение рибосом вдоль открытой рамки считывания общих транслейтомов по сравнению с интерактомами Ssb1, Pfk2p и Fas1p. Здесь показано среднее обогащение Ssb1p, Pfk2p и Fas1p в каждом положении рибосомы вдоль открытой рамки считывания.
Этот метод позволяет идентифицировать и характеризовать различные котрансляционные взаимодействия, обеспечивая функциональный протеом, а также изучение различных заболеваний. На сегодняшний день селективное профилирование рибосом является единственным методом, который может улавливать и характеризовать эти взаимодействия прямым образом in vivo.
