As interações co-translacionais desempenham um papel crucial nas modificações de cadeia nascentes que visam caminhos de dobra e montagem. Aqui, descrevemos o perfil ribossomo seletivo, um método de análise direta in vivo dessas interações no modelo eucariote Saccaromyces cerevisiae. O perfil de ribossomos seletivos é o único método até o momento que captura e caracteriza interações co-translacionais in vivo de forma direta.
O perfil de ribossoma seletivo permite o perfil global de quaisquer fatores e interações com a tradução de ribossomos em resolução de quase codon. Comece coletando as células de levedura construídas contendo as proteínas marcadas desejadas. Realize a lisose celular usando moagem criogênica em um moinho de mistura duas vezes por dois minutos a 30 Hertz.
Centrifugar por dois minutos a 30.000 vezes G a quatro graus Celsius para limpar o lise, e coletar o sobrenatante. Transfira 200 microlitres do supernante para um tubo de microcentrífuga para análise total de RNA e 700 microliters em um tubo de microcentrifuuge para imuno-purificação. Digerir a amostra total de RNA anteriormente separada usando 10 unidades de RNase I por 25 minutos a quatro graus Celsius em um rack de mistura rotativa a 30 rotações por minuto.
Prepare a mistura mestre da almofada de sacarose, conforme descrito no manuscrito do texto. Em seguida, carregue a amostra em 400 microliters da almofada de sacarose e centrífuga por 90 minutos a 245.000 vezes G e a quatro graus Celsius. Remova rapidamente o supernatante com uma bomba de vácuo e sobreponha pelotas com 150 microliters de tampão de lise.
Fixar a amostra com envoltório de parafina e resuspenque as pelotas tremendo por uma hora a quatro graus Celsius a 300 rotações por minuto. Lave de 100 a 400 microlitadores da matriz de ligação de afinidade por amostra três vezes com um mililitro de tampão de lise, reutilizando a matriz de afinidade no tampão de lise. Em seguida, gire a 30 rotações por minuto com um rack de mistura rotativa a quatro graus Celsius por cinco minutos.
Precipitar por centrifugação. Descarte o líquido superior e repita este processo três vezes. Adicione matriz de ligação de afinidade à amostra de imunopuração anteriormente separada e digerir usando RNase I.Gire por 25 minutos a 30 rotações por minuto e quatro graus Celsius com um rack de mistura rotativa para ligar a proteína à matriz de afinidade.
Prepare a mistura mestre do buffer de lavagem, conforme descrito no manuscrito do texto. Lave a matriz de ligação de afinidade com um mililitro de tampão de lavagem por aproximadamente um minuto, girando no rack de mistura. Em seguida, precipitar por centrifugação a 3000 vezes G por 30 segundos a quatro graus Celsius e descartar o líquido superior.
Repita três vezes. Lave mais duas vezes em um mililitro de tampão de lavagem, cada vez por cinco minutos, girando no rack de mistura. Precipitar novamente por centrifugação.
Use 50 microliters de contas para elução de proteínas com a mesma quantidade de tampão amostral 2X. Centrifugar para pelotar as contas e descartar o líquido superior. Elute com 700 microliters de Tris 10 mililitros.
Então, congele em nitrogênio líquido. Remova a amostra do nitrogênio líquido e armazene a menos 80 graus Celsius para ser usada para extração subsequente de RNA. Avalie o sucesso da purificação de afinidade passo por mancha ocidental ou mancha de Coomassie com alíquotas de cada passo usando IP simulado em uma cepa não marcada, tipo selvagem como um controle para ligação não específica à matriz de afinidade.
Os resultados da mancha ocidental após a purificação da afinidade demonstraram o sucesso da expressão proteica marcada. O isolamento das pegadas protegidas por ribossomos foi validado utilizando-se os resultados do bioanalílise. Ao gerar uma biblioteca cDNA para sequenciamento profundo e análise de big data, o subciclamento leva a baixo rendimento.
No entanto, com os dNTPs ainda presentes, a reação prossegue, gerando artefatos PCR mais longos com sequências quimricas devido aos produtos PCR que se primm. A biblioteca gerada foi validada ainda por eletroforese de DNA de alta sensibilidade para distribuição exata de tamanho e quantificação. A biblioteca de sequência foi aparada para adaptadores e códigos de barras e as leituras resultantes foram divididas em diferentes grupos de sequências de codificação, introns e sequências intergênicas.
Perfis ribossos que analisam interações co-translacionais de Vma2p com acompanhantes associados ao ribossomo Ssb1p, Pfk2p e Fas1p são mostrados aqui com o esquema experimental de cada purificação de afinidade. Houve ocupação ribossosome ao longo do quadro de leitura aberta de translatórios totais em comparação com os interactomes Ssb1, Pfk2p e Fas1p. Enriquecimento médio de Ssb1p, Pfk2p e Fas1p em cada posição ribossa ao longo do quadro de leitura aberto é mostrado aqui.
Este método permite a identificação e caracterização das diversas interações co-translacionais, garantindo um proteome funcional, bem como o estudo de diversas doenças. Até o momento, o perfil ribossomo seletivo é o único método que pode capturar e caracterizar essas interações de forma direta in vivo.
