Le interazioni co-traslazionali svolgono un ruolo cruciale nelle nascenti modifiche della catena mirate ai percorsi di piegatura e assemblaggio. Qui, descriviamo il profilo selettivo dei ribosomi, un metodo per l'analisi diretta in vivo di queste interazioni nel modello eucariota Saccaromyces cerevisiae. La profilazione selettiva dei ribosomi è l'unico metodo ad oggi che cattura e caratterizza le interazioni co-traslazionali in vivo in modo diretto.
La profilazione selettiva dei ribosomi consente la profilazione globale di tutti i fattori e le interazioni con la traduzione dei ribosomi nella risoluzione quasi codone. Inizia raccogliendo le cellule di lievito costruite contenenti le proteine marcate desiderate. Eseguire la lisi cellulare utilizzando la macinazione criogenica in un mulino miscelatore due volte per due minuti a 30 Hertz.
Centrifugare per due minuti a 30.000 volte G a quattro gradi Celsius per eliminare il lisato e raccogliere il surnatante. Trasferire 200 microlitri del surnatante in un tubo microcentrifuga per l'analisi totale dell'RNA e 700 microlitri in un tubo microcentrifuga per immunodepurazione. Digerire il campione di RNA totale precedentemente separato utilizzando 10 unità di RNasi I per 25 minuti a quattro gradi Celsius su un rack di miscelazione rotante a 30 rotazioni al minuto.
Preparare il master mix di cuscini di saccarosio come descritto nel manoscritto del testo. Quindi, caricare il campione su 400 microlitri del cuscino di saccarosio e centrifuga per 90 minuti a 245.000 volte G e a quattro gradi Celsius. Rimuovere rapidamente il surnatante con una pompa per vuoto e sovrapporre pellet con 150 microlitri di tampone di lisi.
Fissare il campione con un involucro di paraffina e risospese il pellet agitando per un'ora a quattro gradi Celsius a 300 rotazioni al minuto. Lavare da 100 a 400 microlitri della matrice di legame di affinità per campione tre volte con un millilitro di tampone di lisi riesempendo la matrice di affinità nel tampone di lisi. Quindi, ruotare a 30 rotazioni al minuto con un rack di miscelazione rotante a quattro gradi Celsius per cinque minuti.
Precipitare per centrifugazione. Scartare il liquido superiore e ripetere questo processo tre volte. Aggiungere la matrice di legame di affinità al campione di immunodepurazione precedentemente separato e digerirlo utilizzando RNase I.Ruotare per 25 minuti a 30 rotazioni al minuto e quattro gradi Celsius con un rack di miscelazione rotante per legare la proteina alla matrice di affinità.
Preparare la miscela principale del tampone di lavaggio come descritto nel manoscritto di testo. Lavare la matrice di legame di affinità con un millilitro di tampone di lavaggio per circa un minuto, ruotando nel rack di miscelazione. Quindi, precipitare per centrifugazione a 3000 volte G per 30 secondi a quattro gradi Celsius e scartare il liquido superiore.
Ripeti tre volte. Lavare altre due volte in un millilitro di tampone di lavaggio, ogni volta per cinque minuti, ruotando nel rack di miscelazione. Precipitare di nuovo per centrifugazione.
Utilizzare 50 microlitri di perline per l'eluizione proteica con la stessa quantità di tampone campione 2X. Centrifugare per pellettizzare le perline e scartare il liquido superiore. Elute con 700 microlitri di Tris da 10 millimolari.
Quindi, congelare in azoto liquido. Rimuovere il campione dall'azoto liquido e conservare a meno 80 gradi Celsius da utilizzare per la successiva estrazione dell'RNA. Valutare il successo della fase di purificazione dell'affinità mediante colorazione Western blot o Coomassie con aliquote di ogni fase utilizzando l'IP fittizio su un ceppo wild-type non etichettato come controllo per il legame non specifico alla matrice di affinità.
I risultati di Western blot dopo la purificazione dell'affinità hanno dimostrato il successo dell'espressione proteica marcata. L'isolamento delle impronte protette dai ribosomi è stato convalidato utilizzando i risultati del bioanalizzatore. Durante la generazione di una libreria di cDNA per il sequenziamento profondo e l'analisi dei big data, il sottociclismo porta a una bassa resa.
Tuttavia, con i dNTP ancora presenti, la reazione procede, generando artefatti PCR più lunghi con sequenze chimeriche dovute a prodotti PCR che si innescano. La libreria generata è stata ulteriormente convalidata mediante elettroforesi del DNA ad alta sensibilità per la distribuzione e la quantificazione delle dimensioni esatte. La libreria di sequenze è stata tagliata per adattatori e codici a barre e le letture risultanti sono state divise in diversi gruppi di sequenze codificanti, introni e sequenze intergeniche.
I profili ribosomiali che analizzano le interazioni co-traduzionali di Vma2p con chaperone associato al ribosoma Ssb1p, Pfk2p e Fas1p sono mostrati qui con lo schema sperimentale di ciascuna purificazione di affinità. C'era un'occupazione di ribosomi lungo il frame di lettura aperto dei tradudem totali rispetto agli interattomi Ssb1, Pfk2p e Fas1p. L'arricchimento medio di Ssb1p, Pfk2p e Fas1p in ogni posizione del ribosoma lungo la cornice di lettura aperta è mostrato qui.
Questo metodo consente l'identificazione e la caratterizzazione delle varie interazioni co-traduzionali, garantendo un proteoma funzionale, nonché lo studio di varie malattie. Ad oggi, la profilazione selettiva dei ribosomi è l'unico metodo in grado di catturare e caratterizzare queste interazioni in modo diretto in vivo.
