Les interactions co-traductionnelles jouent un rôle crucial dans les modifications naissantes de la chaîne ciblant les voies de pliage et d’assemblage. Nous décrivons ici le profilage sélectif des ribosomes, une méthode d’analyse directe in vivo de ces interactions dans le modèle eucaryote Saccaromyces cerevisiae. Le profilage sélectif des ribosomes est la seule méthode à ce jour qui capture et caractérise les interactions co-translationnelles in vivo de manière directe.
Le profilage sélectif des ribosomes permet un profilage global de tous les facteurs et interactions avec la traduction des ribosomes en résolution proche du codon. Commencez par collecter les cellules de levure construites contenant les protéines marquées souhaitées. Effectuer la lyse cellulaire à l’aide d’un broyage cryogénique dans un broyeur mélangeur deux fois pendant deux minutes à 30 Hertz.
Centrifuger pendant deux minutes à 30 000 fois G à quatre degrés Celsius pour éliminer le lysat et recueillir le surnageant. Transférer 200 microlitres du surnageant dans un tube de microcentrifugation pour l’analyse de l’ARN total et 700 microlitres dans un tube de microcentrifugation pour l’immuno-purification. Digérer l’échantillon d’ARN total précédemment séparé à l’aide de 10 unités de RNase I pendant 25 minutes à quatre degrés Celsius sur une grille de mélange rotative à 30 rotations par minute.
Préparez le mélange maître de coussin de saccharose tel que décrit dans le manuscrit du texte. Ensuite, chargez l’échantillon sur 400 microlitres du coussin de saccharose et centrifugez pendant 90 minutes à 245 000 fois G et à quatre degrés Celsius. Retirez rapidement le surnageant à l’aide d’une pompe à vide et superposez des pastilles avec 150 microlitres de tampon de lyse.
Fixer l’échantillon avec une pellicule de paraffine et remettre les granulés en les agitant pendant une heure à quatre degrés Celsius à 300 rotations par minute. Lavez trois fois 100 à 400 microlitres de la matrice de liaison d’affinité par échantillon avec un millilitre de tampon de lyse en resusmettant la matrice d’affinité dans le tampon de lyse. Ensuite, tournez à 30 rotations par minute avec une grille de mélange rotative à quatre degrés Celsius pendant cinq minutes.
Précipiter par centrifugation. Jetez le liquide supérieur et répétez ce processus trois fois. Ajouter une matrice de liaison d’affinité à l’échantillon d’immuno-purification précédemment séparé et le digérer à l’aide de RNase I.Faire pivoter pendant 25 minutes à 30 rotations par minute et quatre degrés Celsius avec un rack de mélange rotatif pour lier la protéine à la matrice d’affinité.
Préparez le mélange maître tampon de lavage comme décrit dans le manuscrit textuel. Lavez la matrice de liaison d’affinité avec un millilitre de tampon de lavage pendant environ une minute, en tournant dans la grille de mélange. Ensuite, précipiter par centrifugation à 3000 fois G pendant 30 secondes à quatre degrés Celsius et jeter le liquide supérieur.
Répétez trois fois. Lavez deux fois de plus dans un millilitre de tampon de lavage, chaque fois pendant cinq minutes, en tournant dans la grille de mélange. Précipiter à nouveau par centrifugation.
Utilisez 50 microlitres de billes pour l’élution des protéines avec la même quantité de tampon d’échantillon 2X. Centrifuger pour granuler les perles et jeter le liquide supérieur. Elute avec 700 microlitres de Tris 10 millimolaires.
Ensuite, congeler dans de l’azote liquide. Retirez l’échantillon de l’azote liquide et conservez-le à moins 80 degrés Celsius pour l’utiliser pour l’extraction ultérieure de l’ARN. Évaluez le succès de l’étape de purification d’affinité par transfert Western ou coloration de Coomassie avec des aliquotes de chaque étape en utilisant une ip fictive sur une souche de type sauvage non marquée comme contrôle de la liaison non spécifique à la matrice d’affinité.
Les résultats du transfert Western après purification d’affinité ont démontré le succès de l’expression de la protéine marquée. L’isolement des empreintes protégées par les ribosomes a été validé à l’aide des résultats du bioanalyseur. Lors de la génération d’une bibliothèque d’ADNc pour le séquençage en profondeur et l’analyse de données volumineuses, le sous-cycle conduit à un faible rendement.
Cependant, avec les dNTP toujours présents, la réaction se poursuit, générant des artefacts PCR plus longs avec des séquences chimériques dues à l’amorçage des produits PCR eux-mêmes. La bibliothèque générée a ensuite été validée par électrophorèse de l’ADN à haute sensibilité pour la distribution et la quantification exactes de la taille. La bibliothèque de séquences a été découpée pour les adaptateurs et les codes-barres et les lectures résultantes ont été divisées en différents groupes de séquences de codage, d’introns et de séquences intergéniques.
Les profils de ribosomes analysant les interactions co-translationnelles de Vma2p avec le chaperon associé aux ribosomes Ssb1p, Pfk2p et Fas1p sont présentés ici avec le schéma expérimental de chaque purification d’affinité. Il y avait une occupation des ribosomes le long du cadre de lecture ouvert des translatomes totaux par rapport aux interactomes Ssb1, Pfk2p et Fas1p. L’enrichissement moyen de Ssb1p, Pfk2p et Fas1p à chaque position de ribosome le long du cadre de lecture ouvert est indiqué ici.
Cette méthode permet l’identification et la caractérisation des différentes interactions co-translationnelles, assurant un protéome fonctionnel, ainsi que l’étude de diverses maladies. À ce jour, le profilage sélectif des ribosomes est la seule méthode capable de capturer et de caractériser ces interactions de manière directe in vivo.
