공동 번역 상호 작용은 접이식 및 조립 경로를 목표로하는 초기 체인 수정에 중요한 역할을합니다. 여기에서, 우리는 선택적 리보솜 프로파일링, 진핵생물 사카로마이세스 세레비시아 모델에서 이러한 상호작용의 생체내 직접 분석을 위한 방법을 설명한다. 선택적 리보솜 프로파일링은 생체 내에서 공동-번역 상호작용을 직접적인 방식으로 캡처하고 특성화하는 현재까지 유일한 방법이다.
선택적 리보솜 프로파일링은 모든 인자에 대한 글로벌 프로파일링을 가능하게 하고, 리보솜을 거의 코돈 분해능으로 번역하는 상호작용을 가능하게 합니다. 원하는 태그된 단백질을 함유하는 구축된 효모 세포를 수집함으로써 시작한다. 믹서 밀에서 극저온 분쇄를 사용하여 세포 용해를 30 헤르츠에서 두 분 동안 두 번 수행하십시오.
섭씨 네 도에서 30, 000배 G에서 두 분 동안 원심분리하여 용해물을 제거하고, 상층액을 수집한다. 200 마이크로리터의 상층액을 총 RNA 분석을 위해 마이크로원심분리 튜브에 옮기고 700 마이크로리터를 면역정제를 위해 마이크로원심분리 튜브에 옮깁니다. 이전에 분리된 총 RNA 샘플을 분당 30회 회전으로 회전 혼합 랙 상에서 섭씨 4도에서 25분 동안 RNase I의 10 유닛을 사용하여 소화한다.
텍스트 원고에 설명 된대로 자당 쿠션 마스터 믹스를 준비하십시오. 이어서, 샘플을 400 마이크로리터의 수크로오스 쿠션 상에 로딩하고, 섭씨 4도에서 245, 000배 G 및 4도에서 90분 동안 원심분리한다. 진공 펌프로 상층액을 신속하게 제거하고 150 마이크로 리터의 용해 버퍼로 펠렛을 오버레이하십시오.
파라핀 랩으로 샘플을 고정하고 분당 300 회전으로 섭씨 4도에서 한 시간 동안 흔들어 펠렛을 재현탁하십시오. 친화성 매트릭스를 용해 완충제 내에 재현탁시킴으로써 샘플 당 100 내지 400 마이크로리터의 친화성 결합 매트릭스를 1 밀리리터의 용해 완충액으로 세 번 세척한다. 그런 다음 섭씨 4도에서 회전하는 혼합 랙을 사용하여 분당 30 회전으로 5 분 동안 회전하십시오.
원심분리에 의해 침전시킨다. 상부 액체를 버리고이 과정을 세 번 반복하십시오. 이전에 분리된 면역-정제 샘플에 친화성 결합 매트릭스를 첨가하고, RNase I.Rotate를 사용하여 단백질을 친화성 매트릭스에 결합시키기 위해 회전 혼합 랙으로 분당 30회 및 섭씨 4도에서 25분 동안 소화시킨다.
텍스트 원고에 설명된 대로 세척 완충액 마스터 믹스를 준비한다. 친화성 결합 매트릭스를 약 1분 동안 한 밀리리터의 세척 완충액으로 세척하고, 혼합 랙에서 회전시킨다. 다음으로, 섭씨 4도에서 30초 동안 3000배 G에서 원심분리하여 침전시키고 상부 액체를 버린다.
세 번 반복하십시오. 한 밀리리터의 세척 버퍼에서 두 번 더 씻고, 매번 다섯 분 동안 믹스 랙에서 회전시킵니다. 원심분리에 의해 다시 침전시킨다.
동일한 양의 2X 샘플 버퍼로 단백질 용출을 위해 50 마이크로 리터의 비드를 사용하십시오. 원심분리하여 비드를 펠릿화하고 상부 액체를 버린다. 700 마이크로 리터의 10 밀리몰 트리스로 희석하십시오.
그런 다음 액체 질소에서 동결하십시오. 샘플을 액체 질소로부터 제거하고 영하 80도에서 저장하여 후속 RNA 추출에 사용한다. 친화성 매트릭스에 대한 비특이적 결합에 대한 대조군으로서 태그가 지정되지 않은, 야생형 균주 상에서 모의 IP를 사용하여 각 단계의 분취량으로 웨스턴 블롯 또는 쿠마시 염색에 의한 친화성 정제 단계의 성공을 평가한다.
친화성 정제 후의 웨스턴 블롯 결과는 태그된 단백질 발현의 성공을 입증하였다. 리보솜-보호 발자국의 분리는 바이오분석기로부터의 결과를 사용하여 검증되었다. 심층 시퀀싱 및 빅 데이터 분석을 위한 cDNA 라이브러리를 생성하는 동안, 언더사이클링은 낮은 수율로 이어집니다.
그러나, dNTPs가 여전히 존재하면, 반응이 진행되어, PCR 산물 자체를 프라이밍하기 때문에 키메라 서열로 더 긴 PCR 아티팩트를 생성한다. 생성된 라이브러리는 정확한 크기 분포 및 정량화를 위해 고감도 DNA 전기영동에 의해 추가로 검증되었다. 서열 라이브러리는 어댑터 및 바코드에 대해 트리밍되었고, 결과 판독은 코딩 서열, 인트론 및 인터제닉 서열의 상이한 그룹으로 분할되었다.
Vma2p와 리보솜-관련 샤페론 Ssb1p, Pfk2p 및 Fas1p의 공동 번역 상호작용을 분석하는 리보솜 프로파일은 각 친화성 정제의 실험 계획과 함께 여기에 도시되어 있다. Ssb1, Pfk2p 및 Fas1p 상호 작용과 비교하여 총 반역의 열린 판독 프레임을 따라 리보솜 점유가있었습니다. 개방 판독 프레임을 따라 각각의 리보솜 위치에서 Ssb1p, Pfk2p 및 Fas1p의 평균 농축이 여기에 도시되어 있다.
이 방법은 다양한 공동 번역 상호 작용의 확인 및 특성화를 가능하게하여 기능적 프로테옴을 보장하고 다양한 질병에 대한 연구를 가능하게합니다. 현재까지, 선택적 리보솜 프로파일링은 생체내에서 직접적인 방식으로 이러한 상호작용을 포착하고 특성화할 수 있는 유일한 방법이다.
