Ko-translasyonel etkileşimler, katlama ve montaj yollarını hedefleyen yeni ortaya çıkan zincir modifikasyonlarında çok önemli bir rol oynamaktadır. Burada, eukaryote Saccaromyces cerevisiae modelinde bu etkileşimlerin in vivo doğrudan analizi için bir yöntem olan seçici ribozom profillemesini açıklıyoruz. Seçici ribozom profilleme, bugüne kadar ko-translasyonel etkileşimleri in vivo olarak doğrudan bir şekilde yakalayan ve karakterize eden tek yöntemdir.
Seçici ribozom profilleme, herhangi bir faktörün ve ribozomların kodona yakın çözünürlükte çevrilmesiyle etkileşimlerin küresel profillenmesini sağlar. İstenilen etiketli proteinleri içeren inşa edilmiş maya hücrelerini toplayarak başlayın. Bir karıştırıcı değirmeninde kriyojenik öğütme kullanarak hücre lizisini 30 Hertz'de iki dakika boyunca iki kez gerçekleştirin.
Lisatı temizlemek ve süpernatanı toplamak için 30.000 kez G'de iki dakika boyunca dört santigrat derecede santrifüj yapın. Toplam RNA analizi için süpernatantın 200 mikrolitresini bir mikrosantrifüj tüpüne ve 700 mikrolitreyi immüno-saflaştırma için bir mikrosantrifüj tüpüne aktarın. Daha önce ayrılmış toplam RNA örneğini, dakikada 30 rotasyonda dönen bir karıştırma rafında dört santigrat derecede 25 dakika boyunca 10 birim RNaz I kullanarak sindirin.
Sakkaroz yastığı ana karışımını metin el yazmasında açıklandığı gibi hazırlayın. Daha sonra, numuneyi 400 mikrolitre sakkaroz yastığına yükleyin ve 90 dakika boyunca 245.000 kez G ve dört santigrat derecede santrifüj yapın. Süpernatantı bir vakum pompası ile hızlı bir şekilde çıkarın ve 150 mikrolitre lizis tamponu ile peletleri kaplayın.
Numuneyi parafin sargısı ile sabitleyin ve dakikada 300 dönüşte dört santigrat derecede bir saat çalkalayarak peletleri yeniden askıya alın. Lizis tamponundaki afinite matrisini yeniden askıya alarak numune başına 100 ila 400 mikrolitre afinite bağlama matrisini üç kez bir mililitre lizis tamponu ile yıkayın. Ardından, beş dakika boyunca dört santigrat derecede dönen bir karıştırma rafı ile dakikada 30 dönüşte döndürün.
Santrifüjleme ile çökeltin. Üst sıvıyı atın ve bu işlemi üç kez tekrarlayın. Daha önce ayrılmış immüno-saflaştırma örneğine afinite bağlama matrisi ekleyin ve RNaz I.Proteini afinite matrisine bağlamak için dönen bir karıştırma rafı ile dakikada 30 rotasyonda ve dört santigrat derecede 25 dakika boyunca döndürün.
Yıkama tamponu ana karışımını metin makalesinde açıklandığı şekilde hazırlayın. Afinite bağlama matrisini, karışım rafında dönerek yaklaşık bir dakika boyunca bir mililitre yıkama tamponu ile yıkayın. Daha sonra, dört santigrat derecede 30 saniye boyunca 3000 kez G'de santrifüjleme ile çökeltin ve üst sıvıyı atın.
Üç kez tekrarlayın. Bir mililitre yıkama tamponunda, her seferinde beş dakika boyunca, karışım rafında dönerek iki kez daha yıkayın. Santrifüjleme ile tekrar çökeltin.
Aynı miktarda 2X numune tamponu ile protein elüsyonu için 50 mikrolitre boncuk kullanın. Boncukları peletlemek ve üst sıvıyı atmak için santrifüj. 700 mikrolitre 10 milimolar Tris ile sültü.
Ardından, sıvı azotta dondurun. Numuneyi sıvı azottan çıkarın ve sonraki RNA ekstraksiyonu için kullanılmak üzere eksi 80 santigrat derecede saklayın. Western blot veya Coomassie boyama ile afinite saflaştırma adımının başarısını, afinite matrisine spesifik olmayan bağlanma için bir kontrol olarak, etiketlenmemiş, vahşi tip bir suşta sahte IP kullanarak her adımın alikotlarıyla değerlendirin.
Afinite saflaştırmasından sonra Western blot sonuçları, etiketli protein ekspresyonunun başarısını göstermiştir. Ribozom korumalı ayak izlerinin izolasyonu, biyoanalizörden elde edilen sonuçlar kullanılarak doğrulandı. Derin dizileme ve büyük veri analizi için bir cDNA kütüphanesi oluştururken, düşük döngü düşük verime yol açar.
Bununla birlikte, dNTP'ler hala mevcut olduğunda, reaksiyon devam eder ve PCR ürünlerinin kendilerini hazırlaması nedeniyle kimerik dizilerle daha uzun PCR artefaktları üretir. Oluşturulan kütüphane, kesin boyut dağılımı ve niceliği için yüksek hassasiyetli DNA elektroforezi ile daha da doğrulandı. Dizi kütüphanesi adaptörler ve barkodlar için kesildi ve elde edilen okumalar farklı kodlama dizileri, intronlar ve intergenik diziler gruplarına ayrıldı.
Vma2p'nin ribozomla ilişkili şaperon Ssb1p, Pfk2p ve Fas1p ile birlikte translasyonel etkileşimlerini analiz eden ribozom profilleri, her bir afinite saflaştırmasının deneysel şemasıyla birlikte burada gösterilmiştir. Toplam translatomların açık okuma çerçevesi boyunca Ssb1, Pfk2p ve Fas1p interaktomlarına kıyasla ribozom doluluğu vardı. Açık okuma çerçevesi boyunca her ribozom pozisyonunda Ssb1p, Pfk2p ve Fas1p'nin ortalama zenginleştirilmesi burada gösterilmiştir.
Bu yöntem, çeşitli ko-translasyonel etkileşimlerin tanımlanmasını ve karakterizasyonunu, fonksiyonel bir proteomun yanı sıra çeşitli hastalıkların incelenmesini sağlar. Bugüne kadar, seçici ribozom profilleme, bu etkileşimleri in vivo olarak doğrudan yakalayabilen ve karakterize edebilen tek yöntemdir.
