Co-translationale Interaktionen spielen eine entscheidende Rolle bei entstehenden Kettenmodifikationen, die auf Falt- und Montagepfade abzielen. Hier beschreiben wir das selektive Ribosomenprofiling, eine Methode zur in vivo direkten Analyse dieser Wechselwirkungen im Modell-Eukaryoten Saccaromyces cerevisiae. Selektives Ribosomenprofiling ist die bisher einzige Methode, die co-translationale Interaktionen in vivo direkt erfasst und charakterisiert.
Die selektive Ribosomenprofilierung ermöglicht die globale Profilerstellung aller Faktoren und Wechselwirkungen mit der Übersetzung von Ribosomen in nahezu codonischer Auflösung. Beginnen Sie mit dem Sammeln der konstruierten Hefezellen, die die gewünschten markierten Proteine enthalten. Führen Sie die Zelllyse mittels kryogener Vermahlung in einer Mischermühle zweimal für zwei Minuten bei 30 Hertz durch.
Zentrieren Sie zwei Minuten bei 30.000 mal G bei vier Grad Celsius, um das Lysat zu reinigen, und sammeln Sie den Überstand. Übertragen Sie 200 Mikroliter des Überstands in ein Mikrozentrifugenröhrchen für die gesamte RNA-Analyse und 700 Mikroliter in ein Mikrozentrifugenröhrchen zur Immunreinigung. Fermentieren Sie die zuvor getrennte gesamte RNA-Probe mit 10 Einheiten RNase I für 25 Minuten bei vier Grad Celsius auf einem rotierenden Mischgestell mit 30 Umdrehungen pro Minute.
Bereiten Sie die Saccharose-Kissen-Mastermischung wie im Textmanuskript beschrieben vor. Dann laden Sie die Probe auf 400 Mikroliter des Saccharosekissens und zentrifugieren Sie für 90 Minuten bei 245.000 mal G und bei vier Grad Celsius. Entfernen Sie den Überstand schnell mit einer Vakuumpumpe und überlagern Sie Pellets mit 150 Mikrolitern Lysepuffer.
Sichern Sie die Probe mit Paraffinumhüllung und suspendieren Sie die Pellets, indem Sie eine Stunde lang bei vier Grad Celsius bei 300 Umdrehungen pro Minute schütteln. Waschen Sie 100 bis 400 Mikroliter der Affinitätsbindungsmatrix pro Probe dreimal mit einem Milliliter Lysepuffer, indem Sie die Affinitätsmatrix im Lysepuffer resuspendieren. Drehen Sie sich dann mit 30 Umdrehungen pro Minute mit einem rotierenden Mischgestell bei vier Grad Celsius für fünf Minuten.
Fällung durch Zentrifugation. Entsorgen Sie die obere Flüssigkeit und wiederholen Sie diesen Vorgang dreimal. Fügen Sie der zuvor getrennten Immunreinigungsprobe eine Affinitätsbindungsmatrix hinzu und verdauen Sie sie mit RNase I.Rotieren Sie sie für 25 Minuten bei 30 Umdrehungen pro Minute und vier Grad Celsius mit einem rotierenden Mischgestell, um das Protein an die Affinitätsmatrix zu binden.
Bereiten Sie die Waschpuffer-Mastermischung wie im Textmanuskript beschrieben vor. Waschen Sie die Affinitätsbindungsmatrix mit einem Milliliter Waschpuffer etwa eine Minute lang und drehen Sie sie im Mix-Rack. Als nächstes fallen Sie durch Zentrifugation bei 3000 mal G für 30 Sekunden bei vier Grad Celsius aus und entsorgen Sie die obere Flüssigkeit.
Wiederholen Sie dies dreimal. Noch zweimal in einem Milliliter Waschpuffer waschen, jedes Mal fünf Minuten lang, im Mix-Rack drehen. Durch Zentrifugation wieder ausfallen.
Verwenden Sie 50 Mikroliter Perlen für die Proteinelution mit der gleichen Menge an 2X Probenpuffer. Zentrifuge, um die Perlen zu pelletieren und die obere Flüssigkeit zu entsorgen. Elute mit 700 Mikrolitern 10-millimolärem Tris.
Dann in flüssigem Stickstoff einfrieren. Entfernen Sie die Probe aus flüssigem Stickstoff und lagern Sie sie bei minus 80 Grad Celsius, um sie für die anschließende RNA-Extraktion zu verwenden. Bewerten Sie den Erfolg des Affinitätsreinigungsschritts durch Western Blot oder Coomassie-Färbung mit Aliquots jedes Schritts unter Verwendung von Mock-IP auf einer nicht markierten Wildtyp-Sorte als Kontrolle für unspezifische Bindung an die Affinitätsmatrix.
Western Blot-Ergebnisse nach der Affinitätsreinigung zeigten den Erfolg der markierten Proteinexpression. Die Isolierung von Ribosomen-geschützten Fußabdrücken wurde anhand der Ergebnisse des Bioanalyzers validiert. Während eine cDNA-Bibliothek für Deep Sequencing und Big-Data-Analyse generiert wird, führt Undercycling zu einer geringen Ausbeute.
Da die dNTPs jedoch noch vorhanden sind, verläuft die Reaktion weiter und erzeugt längere PCR-Artefakte mit chimären Sequenzen, da sich PCR-Produkte selbst vorbereiten. Die generierte Bibliothek wurde durch hochempfindliche DNA-Elektrophorese zur exakten Größenverteilung und Quantifizierung weiter validiert. Die Sequenzbibliothek wurde auf Adapter und Barcodes zugeschnitten und die resultierenden Lesevorgänge wurden in verschiedene Gruppen von Codierungssequenzen, Introns und intergenen Sequenzen unterteilt.
Ribosomenprofile, die co-translationale Interaktionen von Vma2p mit dem Ribosomen-assoziierten Chaperon Ssb1p, Pfk2p und Fas1p analysieren, werden hier mit dem experimentellen Schema jeder Affinitätsreinigung gezeigt. Es gab eine Ribosomenbelegung entlang des offenen Leserahmens von Gesamttranslatomen im Vergleich zu Ssb1-, Pfk2p- und Fas1p-Interaktome. Die mittlere Anreicherung von Ssb1p, Pfk2p und Fas1p an jeder Ribosomenposition entlang des offenen Leserahmens ist hier dargestellt.
Diese Methode ermöglicht die Identifizierung und Charakterisierung der verschiedenen co-translationalen Interaktionen, die ein funktionelles Proteom gewährleisten, sowie die Untersuchung verschiedener Krankheiten. Bis heute ist die selektive Ribosomenprofilierung die einzige Methode, die diese Interaktionen in vivo direkt erfassen und charakterisieren kann.
