אינטראקציות של תרגום משותף ממלאות תפקיד מכריע בשינויי שרשרת מתהווים המכוונים למסלולי קיפול והרכבה. כאן, אנו מתארים פרופיל ריבוזומים סלקטיבי, שיטה לניתוח ישיר in vivo של אינטראקציות אלה במודל אאוקריוט Saccaromyces cerevisiae. פרופיל ריבוזומים סלקטיבי הוא השיטה היחידה עד כה שלוכדת ומאפיינת אינטראקציות בין תרגומים משותפים in vivo באופן ישיר.
פרופיל ריבוזומים סלקטיבי מאפשר פרופיל גלובלי של כל הגורמים והאינטראקציות עם תרגום ריבוזומים ברזולוציה של כמעט קודון. התחילו באיסוף תאי השמרים הבנויים המכילים את החלבונים המתויגים הרצויים. בצע ליזיס תאי באמצעות טחינה קריוגנית במפעל מיקסר פעמיים במשך שתי דקות ב 30 הרץ.
צנטריפוגה במשך שתי דקות ב 30, 000 פעמים G בארבע מעלות צלזיוס כדי לנקות את הליזאט, ולאסוף את supernatant. העברת 200 מיקרוליטרים של הסופרנטנט לצינור מיקרוצנטריפוג' לצורך ניתוח RNA כולל ו-700 מיקרוליטרים לתוך צינור מיקרו-צנטריפוגה לטיהור חיסוני. לעכל את דגימת הרנ"א הכוללת שהופרדה בעבר באמצעות 10 יחידות של RNase I למשך 25 דקות בארבע מעלות צלזיוס על מתלה ערבוב מסתובב ב-30 סיבובים לדקה.
הכן את תערובת המאסטר של כרית הסוכרוז כמתואר בכתב היד של הטקסט. לאחר מכן, טען את הדגימה על 400 מיקרוליטרים של כרית הסוכרוז והצנטריפוגה למשך 90 דקות ב 245, 000 פעמים G ובארבע מעלות צלזיוס. הסר את ה-supernatant במהירות באמצעות משאבת ואקום וכיסה כדוריות עם 150 מיקרוליטרים של מאגר ליזיס.
אבטחו את הדגימה באמצעות עטיפת פרפין והחזירו את הכדורים על ידי טלטול במשך שעה אחת בארבע מעלות צלזיוס ב-300 סיבובים לדקה. שטפו 100 עד 400 מיקרוליטרים של מטריצת קשירה של זיקה לכל דגימה שלוש פעמים עם מיליליטר אחד של מאגר ליזיס על ידי שימוש חוזר במטריצת הזיקה במאגר הליזיס. לאחר מכן, סובבו ב-30 סיבובים לדקה עם מתלה ערבוב מסתובב בארבע מעלות צלזיוס במשך חמש דקות.
לזרז על ידי צנטריפוגה. יש להשליך את הנוזל העליון ולחזור על תהליך זה שלוש פעמים. הוסיפו את מטריצת קשירת הזיקה לדגימת הטיהור החיסוני שהופרדה בעבר ועיכלו אותה באמצעות RNase I.סובבו אותה במשך 25 דקות ב-30 סיבובים לדקה וארבע מעלות צלזיוס עם מתלה ערבוב מסתובב כדי לקשור את החלבון למטריצת הזיקה.
הכן את תערובת המאסטר של מאגר הכביסה כמתואר בכתב היד של הטקסט. שטפו את מטריצת קשירה של זיקה עם מיליליטר אחד של חיץ שטיפה למשך כדקה, תוך סיבוב במדף התערובת. לאחר מכן, לזרז על ידי צנטריפוגה ב 3000 פעמים G במשך 30 שניות בארבע מעלות צלזיוס ולהשליך את הנוזל העליון.
חזרו על הפעולה שלוש פעמים. יש לשטוף פעמיים נוספות במיליליטר אחד של מאגר שטיפה, בכל פעם במשך חמש דקות, תוך סיבוב במדף התערובת. לזרז שוב על ידי צנטריפוגה.
השתמש ב-50 מיקרוליטרים של חרוזים לאליטיון חלבונים עם אותה כמות של מאגר דגימות פי 2. צנטריפוגה כדי לכדור את החרוזים ולהשליך את הנוזל העליון. Elute עם 700 מיקרוליטרים של 10 מילימולאר טריס.
לאחר מכן, להקפיא חנקן נוזלי. הסר את הדגימה מחנקן נוזלי ואחסן במינוס 80 מעלות צלזיוס כדי לשמש למיצוי RNA לאחר מכן. הערך את ההצלחה של שלב טיהור הזיקה על ידי כתם מערבי או צביעת Coomassie עם aliquots של כל שלב באמצעות IP מדומה על זן לא מתויג, מסוג פראי כבקרה לקשירת קשר לא ספציפית למטריצת הזיקה.
תוצאות כתם מערבי לאחר טיהור הזיקה הדגימו את הצלחת ביטוי החלבון המתויג. בידוד של עקבות מוגנות ריבוזומים אומת באמצעות התוצאות מהביואנליזר. תוך יצירת ספריית cDNA לריצוף עמוק וניתוח ביג דאטה, תת-מחזור מוביל לתפוקה נמוכה.
עם זאת, כאשר ה- dNTPs עדיין קיימים, התגובה ממשיכה, ומייצרת ממצאי PCR ארוכים יותר עם רצפים כימריים עקב מוצרי PCR המתחילים את עצמם. הספרייה שנוצרה אומתה עוד יותר על ידי אלקטרופורזה של דנ"א ברגישות גבוהה לצורך התפלגות וכימות בגודל מדויק. ספריית הרצף נחתכה עבור מתאמים וברקודים והקריאות שהתקבלו חולקו לקבוצות שונות של רצפי קידוד, אינטרונים ורצפים אינטרגניים.
פרופילי ריבוזום המנתחים אינטראקציות תרגומיות משותפות של Vma2p עם מלווה הקשור לריבוזום Ssb1p, Pfk2p ו- Fas1p מוצגים כאן עם הסכימה הניסיונית של כל טיהור זיקה. הייתה תפוסת ריבוזומים לאורך מסגרת הקריאה הפתוחה של סך התרגומים בהשוואה לאינטראקציות Ssb1, Pfk2p ו- Fas1p. העשרה ממוצעת של Ssb1p, Pfk2p ו- Fas1p בכל מיקום ריבוזום לאורך מסגרת הקריאה הפתוחה מוצגת כאן.
שיטה זו מאפשרת זיהוי ואפיון של האינטראקציות השונות בין התרגומים המשותפים, ומבטיחה פרוטאום תפקודי, כמו גם חקר מחלות שונות. נכון להיום, פרופיל ריבוזומים סלקטיבי הוא השיטה היחידה שיכולה ללכוד ולאפיין את האינטראקציות הללו באופן ישיר in vivo.
