Une reprogrammation directe pour générer des mélanocytes a été rapportée. Cependant, divers facteurs de transcription sont utilisés dans différentes études. Dans ce protocole, nous avons validé et réduit le nombre de facteurs de transcription toujours avec une efficacité de reprogrammation plus élevée.
Nous avons établi un système de reprogrammation directe pour générer des mélanocytes en utilisant seulement trois facteurs de transcription, Mitf, Sox10 et PAX3, et modifié le système de culture pour le rendre plus stable et robuste. Comment régénérer les mélanocytes fonctionnels est une question importante qui peut aider à résoudre les limites thérapeutiques pour les maladies de dépigmentation comme le vitiligo. La bonne reprogrammation fournit une perspective Notre technique a les caractéristiques de commodité, de forte opérabilité et de stabilité, ce qui est plus facile à promouvoir et à répéter.
Pour commencer la production du lentivirus concentré, plaquez 1,5 fois 10 aux 6 cellules HEK-293T dans une boîte de 60 millimètres et cultivez les cellules avec un milieu normal à 37 degrés Celsius dans un incubateur humidifié avec 5% de dioxyde de carbone. Après 24 heures d’incubation, lorsque les cellules HEK-293T ont atteint 80 à 90% de confluence, remplacez le milieu par 3,5 mL de DMEM, puis incubez les cellules à 37 degrés Celsius dans un incubateur humidifié avec 5% de dioxyde de carbone pendant deux heures. Après avoir retiré les cellules de l’incubateur, remplacez le milieu par du DMEM contenant 2% de FBS et ajoutez le mélange complexe de transfection fraîchement préparé aux cellules de manière goutte à goutte.
Mélanger doucement le mélange liquide. À la fin de huit heures, changez le milieu cellulaire avec 3,5 mL de milieu normal. Prélever le surnageant du virus à 24 et 48 heures.
Ensuite, mélangez les surnageants du virus collectés à deux moments différents et centrifugez le mélange à 200 xg pendant cinq minutes à quatre degrés Celsius. Ensuite, passez le surnageant collecté à travers des filtres de 0,45 micron pour recueillir le filtrat dans un tube conique stérile de 50 mL. Concentrer le surnageant du virus filtré par centrifugation à 6 000 xg à quatre degrés Celsius pendant la nuit.
Une fois cela fait, assurez-vous que la pastille virale est visible au fond du tube conique. Versez le surnageant lentement. Pour dissoudre la pastille virale dans le milieu normal avec un par 100ème * volume du surnageant du virus.
Utilisez une micropipette P1000 pour pipeter doucement de haut en bas jusqu’à l’obtention d’un mélange homogène de virus concentré 100x. Divisez le virus concentré dans les tubes de microcentrifugation pour le stocker à 80 degrés Celsius. Plaque 1 fois 10 à la 5ème cellule HEK-293T dans un puits d’une plaque de six puits.
Cultivez ces cellules avec le milieu normal à 37 degrés Celsius dans un incubateur humidifié avec 5% de dioxyde de carbone. Après 24 heures, ajouter 0,1 à 0,2 microlitre du virus concentré fluorescent 100x à chaque puits. Suivi de l’ajout de quatre nanogrammes par microlitre du réactif de transfection polymère cationique à chaque puits.
Environ huit à douze heures après l’infection par le virus, remplacez le milieu par le milieu normal. Quarante-huit heures après l’infection, lavez la vaisselle avec 1 mL de PBS stérile pour éliminer les cellules mortes. Ensuite, essayez les cellules en utilisant 250 microlitres de solution de trypsine-EDTA à 0,05% par puits d’une plaque de six puits à température ambiante.
Centrifugez la plaque à 200 xg pendant cinq minutes à quatre degrés Celsius. Après avoir retiré le surnageant, remettez en suspension la pastille de cellule dans un mL de PBS et ajoutez la suspension de cellule à un tube à fond rond en polystyrène de cinq mL. Placez ensuite le tube dans le cytomètre en flux pour analyser l’échantillon.
Pour la reprogrammation directe des fibroblastes, recouvrir un puits d’une plaque de culture cellulaire à six puits avec 1 mL de solution de gélatine à 0,1% à température ambiante. Après 15 à 30 minutes, lorsque le puits est complètement recouvert de gélatine, aspirer une solution de gélatine à 0,1%. Ensuite, plaquez 5 fois 10 à la 4ème fibroblaste embryonnaire de souris, ou MEF, dans un puits d’une plaque de six puits recouverte de 0,1% de gélatine, et cultivez les cellules pendant la nuit avec le milieu normal à 37 degrés Celsius dans un incubateur humidifié avec 5% de dioxyde de carbone.
Après 24 heures, lorsque les MEF ont atteint 40 à 50% de confluence, remplacez le milieu par le milieu normal. Ensuite, faites fondre le virus congelé et concentré sur de la glace. Calculez le volume du virus à ajouter à l’aide de l’équation, puis ajoutez le virus concentré pour les six facteurs de transcription à chaque puits, en fonction du volume calculé.
Ajouter quatre microgrammes par mL de l’agent de transfection polymère cationique au puits. Considérez-le comme le jour zéro de l’infection à lentivirus. Le premier jour, après 8 à 12 heures d’infection, remplacez le milieu contenant le virus par le milieu normal frais, tout en ajoutant 0,5 microgramme par mL de puromycine pour dépister les lignées cellulaires infectées stables.
Le deuxième jour, 48 heures après l’infection, remplacez progressivement le milieu surnageant par le milieu de reprogrammation. Modifiez un quart du volume moyen total avant d’ajouter trois CHIR99021 micromolaires. Du troisième au septième jour, en fonction de l’état des cellules, changez le milieu en le remplaçant progressivement par une proportion plus élevée de milieu de reprogrammation pour passer au milieu de reprogrammation complet dans les cinq jours.
Ensuite, détachez les cellules avec 500 microlitres d’enzyme digestive 0,05% trypsine-EDTA pendant trois minutes à température ambiante. Lorsqu’environ soixante pour cent des cellules ont flotté, arrêtez la digestion en ajoutant le milieu normal, deux fois le volume de l’enzyme digestive. Recueillir la suspension cellulaire dans un tube conique stérile de 15 mL pour centrifuger à 200 xg pendant cinq minutes à quatre degrés Celsius.
Retirez le surnageant avant de suspendre à nouveau la pastille cellulaire avec le milieu de reprogrammation. Lorsque vous avez terminé, plaquez les cellules re-suspendues dans un plat stérile de 60 millimètres. Cultivez les cellules à 37 degrés Celsius dans un incubateur humidifié à 5% de dioxyde de carbone.
Après quarante-huit heures d’infection à lentivirus dans les cellules HEK-293T, le succès de la production concentrée de lentivirus a été évalué en observant l’intensité de fluorescence de la GFP ou par cytométrie en flux. Le titre du virus concentré s’est avéré élevé entre 10 et 8e TU/mL. Au cours de la reprogrammation directe des fibroblastes, la morphologie cellulaire a changé progressivement en synapse cellulaire allongée et en noyaux cellulaires élargis.
Cependant, les cellules vieillissaient progressivement après le vingtième jour. L’élimination des facteurs de transcription, Mitf, Pax3 ou Sox10, a entraîné le silence de l’expression des gènes mélanocytaires, Tyr, Tyrp1 et Mlana, indiquant le plus grand impact sur la conversion des fibroblastes en mélanocytes. Par conséquent, l’expression des gènes mélanocytaires induits par la programmation directe avec trois facteurs de transcription était plus élevée par rapport à six facteurs de transcription.
Pour identifier les mélanocytes induits par meF, ou iMels, l’expression de marqueurs mélanocytaires, TYRP1 et DCT a été détectée à l’aide d’une coloration immunofluorescente. De plus, les méthodes de coloration spécifiques à la mélanine telles que la coloration DOPA et Masson-Fontana ont montré des résultats positifs. Les cellules 293T doivent être réparties uniformément.
En outre, l’ajout de mélange de transfection aux cellules doit être fait doucement pour empêcher les cellules de flotter. Le protocole est stable et pratique et peut être utilisé pour reprogrammer d’autres types de cellules. Il prévoit de fournir une référence et une stratégie pour la reprogrammation directe in vivo de la régénération des mélanocytes dans la médecine future.
