直接重编程以产生黑素细胞已有报道。然而，不同的研究中使用了各种转录因子。在该协议中，我们验证并减少了转录因子数，仍然具有更高的重编程效率。
我们建立了一个直接重编程系统，仅使用三种转录因子Mitf，Sox10和PAX3来生成黑素细胞，并修改了培养系统以使其更加稳定和稳健。如何再生功能性黑素细胞是一个重要的问题，可能有助于解决白癜风等色素沉着疾病的治疗限制。正确的重编程提供了前瞻性 我们的技术具有方便、可操作性强、稳定性好等特点，更易于推广和重复。
要开始生产浓缩的慢病毒，将1.5倍10倍的6个HEK-293T细胞放入60毫米培养皿中，并在37摄氏度下用正常培养基培养细胞在加湿培养箱中用5%二氧化碳培养。孵育24小时后，当HEK-293T细胞达到80%至90%汇合时，用3.5mL DMEM替换培养基，然后将细胞在37摄氏度下在加湿培养箱中用5%二氧化碳孵育两小时。从培养箱中取出细胞后，用含有2%FBS的DMEM替换培养基，并以滴剂方式将新鲜制备的转染复合物混合物加入细胞中。
轻轻混合液体混合物。在完成8小时后，用3.5 mL正常培养基更换细胞培养基。在24和48小时收集病毒上清液。
接下来，将两个不同时间点收集的病毒上清液混合，并在4摄氏度下以200 xg离心混合物5分钟。然后将收集的上清液通过0.45微米过滤器，将滤液收集在50mL无菌锥形管中。将过滤后的病毒上清液在4摄氏度下以6， 000 xg离心浓缩过夜。
完成后，确保病毒沉淀在锥形管的底部可见。慢慢倒出上清液。用于将病毒沉淀溶解在具有100倍*体积的病毒上清液的正常培养基中。
使用P1000微量移液管轻轻上下移液，直到获得均匀的100x浓缩病毒混合物。将浓缩的病毒分成微量离心管，以80摄氏度储存。将1次10至第5个HEK-293T细胞放入一孔六孔板中。
在装有5%二氧化碳的加湿培养箱中，用37摄氏度的正常培养基培养这些细胞。24小时后，向每个孔中加入0.1至0.2微升的100倍荧光浓缩病毒。随后向每个孔中加入每微升四纳克阳离子聚合物转染试剂。
感染病毒后约8至12小时，用正常培养基替换培养基。感染后四十八小时，用1毫升无菌PBS清洗培养皿以除去死细胞。然后在室温下使用每孔六孔板的250微升0.05%胰蛋白酶-EDTA溶液对细胞进行胰蛋白酶消化。
将板以200 xg在四摄氏度下离心五分钟。除去上清液后，将细胞沉淀重新悬浮在一mLPBS中，并将细胞悬浮液加入五mL聚苯乙烯圆底管中。然后将管放入流式细胞仪中分析样品。
对于成纤维细胞的直接重编程，在室温下用1 mL 0.1%明胶溶液涂覆一孔六孔细胞培养板。15~30分钟后，当孔完全被明胶覆盖时，吸出0.1%明胶溶液。接下来，将5次10次到第4只小鼠胚胎成纤维细胞（MEF）中，放入一孔涂有0.1%明胶的六孔板中，并用37摄氏度的正常培养基在具有5%二氧化碳的加湿培养箱中培养细胞过夜。
24小时后，当MEF达到40%至50%汇合度时，用普通培养基替换培养基。接下来，在冰上融化冷冻的浓缩病毒。使用等式计算要添加的病毒的体积，然后根据计算的体积将六个转录因子的浓缩病毒添加到每个孔中。
向孔中加入每毫升四微克的阳离子聚合物转染剂。将其视为慢病毒感染的第零天。在第一天，感染8至12小时后，用新鲜的正常培养基替换含有病毒的培养基，同时每毫升加入0.5微克嘌呤霉素以筛选稳定的感染细胞系。
在感染后第二天，48小时，用重编程培养基逐渐替换上清液培养基。在添加三个微摩尔CHIR99021之前，请改变总培养基体积的四分之一。从第三天到第七天，根据细胞的状况，通过逐渐用更高比例的重编程培养基替换培养基来改变培养基，以便在五天内切换到完全重编程培养基。
接下来，用500微升0.05%胰蛋白酶-EDTA消化酶在室温下分离细胞三分钟。当大约百分之六十的细胞漂浮起来时，通过添加正常培养基（消化酶体积的两倍）来停止消化。将细胞悬浮液收集在15mL无菌锥形管中，以200 xg在4摄氏度下离心5分钟。
除去上清液，然后用重编程培养基重新悬浮细胞沉淀。完成后，将重新悬浮的细胞接种在60毫米无菌培养皿中。在37摄氏度下在加湿的5%二氧化碳培养箱中培养细胞。
在HEK-293T细胞中慢病毒感染48小时后，通过观察GFP的荧光强度或流式细胞术来评估浓缩慢病毒生产的成功。发现浓缩病毒的滴度在10至第8个TU / mL时很高。在成纤维细胞的直接重编程过程中，细胞形态逐渐变为细长的细胞突触和增大的细胞核。
然而，细胞在第二十天后逐渐老化。去除转录因子Mitf，Pax3或Sox10导致黑素细胞基因Tyr，Tyrp1和Mlana表达的沉默，表明对成纤维细胞转化为黑素细胞的影响最大。因此，与六种转录因子相比，使用三种转录因子直接编程诱导的黑素细胞基因的表达更高。
为了鉴定MEF诱导的黑素细胞或iMels，使用免疫荧光染色检测黑素细胞标志物TYRP1和DCT的表达。此外，黑色素特异性染色方法如DOPA和Masson-Fontana染色显示出积极的结果。293T细胞应均匀分布。
此外，必须轻轻地向细胞中添加转染混合物，以防止细胞漂浮。该方案稳定实用，可用于重新编程其他类型的细胞。有望为未来医学中黑素细胞再生的体内直接重编程提供参考和策略。
