الليزوزومات هي أنظمة التخلص من القمامة في الخلية. الأنشطة الليزوزومية ديناميكية للغاية ويصعب التقاطها. في هذه الدراسة ، قمنا بتطوير نهج البروتينات لوضع العلامات عن قرب لفك رموز البيئة المكروية الليزوزومية في الخلايا العصبية البشرية الحية.
يلتقط هذا النهج بروتينات غشاء الليزوزوم والتفاعلات المستقرة والعابرة مع الخلايا العصبية الليزوزومية والمشتقة من iPSC. الخلل الوظيفي الليزوزومي متورط بشدة في أمراض الدماغ المختلفة. يمكن تطبيق هذه التقنية لفهم أمراض الدماغ المختلفة وتوفير أهداف جزيئية محتملة لتصميم علاجات جديدة.
لبدء إجراء وضع العلامات على القرب ، راقب الخلايا العصبية تحت المجهر للتأكد من أنها على قيد الحياة وصحية. خذ نصف حجم الوسط من المزرعة لخلطه مع فينول البيوتين وأضفه مرة أخرى إلى الخلايا العصبية بتركيز نهائي يبلغ 500 ميكرومولار لمدة 30 دقيقة في حاضنة 37 درجة مئوية. ابدأ تفاعل وضع العلامات عن طريق إضافة محلول بيروكسيد الهيدروجين المحضر حديثا إلى مزرعة الخلايا العصبية بتركيز نهائي واحد مليمول.
بعد حضانة لمدة دقيقة واحدة ، استنشاق الوسط وشطف الثقافة ثلاث مرات مع إخماد العازلة. قم بإمالة اللوحة لشفط كل المخزن المؤقت المتبقي. بعد إضافة محلول تحلل الجليد البارد ، اكشط تحلل الخلية في أنابيب باردة سعة 1.5 ملليلتر.
قم بتسخين الأنابيب في حمام ماء مثلج بأكثر من 100 واط لمدة 15 دقيقة مع دورات بديلة مدتها 40 ثانية و 20 ثانية متوقفة. بعد تحلل الخلية، أضف الأسيتون البارد عند 20 درجة سلزية تحت الصفر إلى العينة بحجم أربعة أضعاف من محلول تحلل الخلية. دوامة لفترة وجيزة واحتضان في ناقص 20 درجة مئوية لمدة ثلاث ساعات لترسيب البروتينات وإزالة بقايا الفينول البيوتين.
الطرد المركزي أنبوب تحلل الخلية في 16،500 مرة G لمدة 10 دقائق عند درجتين مئويتين وإزالة بعناية الطاف دون إزعاج بيليه البروتين. ثم, غسل بيليه مرتين مع ملليلتر واحد من الأسيتون في ناقص 20 درجة مئوية, تليها الطرد المركزي وإزالة المادة الطافية. بعد ذلك ، جفف حبيبات البروتين بمكثف فراغ لمدة دقيقة واحدة.
أضف محلول تحلل الخلية لإذابة الحبيبات تماما باستخدام دوامة أو صوتنة. خذ 20 ميكرولتر من القسمة لتحديد تركيز البروتين الكلي بواسطة مقايسة DCA. قم بتخزين محلول الخلية المتبقي عند 80 درجة مئوية تحت الصفر.
خذ عينة تحلل البروتين من الفريزر ناقص 80 درجة مئوية وصوتنة أنبوب العينة لمدة 30 ثانية للذوبان السريع. دوامة ، أجهزة طرد مركزي لفترة وجيزة مع جهاز طرد مركزي صغير على الطاولة ، ووضع أنبوب العينة على الجليد. بعد ذلك ، قم بنقل 250 ميكرولتر من ملاط حبة الستربتافيدين المغناطيسية إلى كل أنبوب سعة 1.5 ملليلتر.
ضع هذه الأنابيب على رف مغناطيسي لمدة دقيقة واحدة ، واغسل الخرز ثلاث مرات بملليلتر واحد من محلول كبريتات دوديسيل الصوديوم بنسبة 2٪ ، وقم بإزالة المخزن المؤقت المتبقي. بناء على تركيز البروتين الكلي لتحلل الخلية ونتائج مقايسة معايرة الخرز، أضف الكمية المحسوبة من عينة البروتين اللازمة ل 250 ميكرولتر من ملاط حبة الستربتافيدين المغناطيسية. بعد ذلك ، أضف محلول تحلل الخلية إلى خليط محللة الخرز المغناطيسي إلى الحجم الكلي البالغ ميكرولتر واحد وقم بتدوير الأنبوب طوال الليل عند أربع درجات مئوية.
في اليوم التالي ، قم بجهاز طرد مركزي لأنبوب العينة لفترة وجيزة على جهاز طرد مركزي دقيق على الطاولة وضع الأنبوب على رف مغناطيسي لمدة دقيقة واحدة لإزالة المادة الطافية. بعد ذلك ، اغسل الخرز مرتين باستخدام ملليلتر واحد من محلول الغسيل A مع خمس دقائق من الدوران في درجة حرارة الغرفة. كرر العملية مع كل مخزن مؤقت للغسيل مرتين ، بالتتابع ، مع المخزن المؤقت B ، والمخزن المؤقت C ، والمخزن المؤقت D عند أربع درجات مئوية.
ضع الأنبوب على رف مغناطيسي لمدة دقيقة واحدة وقم بإزالة المادة الطافية. بعد ذلك ، أعد تعليق الحبيبات في 100 ميكرولتر من TCEP خمسة ملليمولار في محلول Tris سعة 50 ملليمولار لاحتضانها لمدة 30 دقيقة على خلاط حراري عند 37 درجة مئوية ، تليها إضافة 15 ملليمولار IAA لمدة 30 دقيقة في الظلام وإضافة TCEP خمسة ملليمولار لمدة خمس دقائق لإخماد بقايا IAA. جهاز طرد مركزي أنبوب العينة لفترة وجيزة على جهاز طرد مركزي دقيق ووضع الأنبوب على رف مغناطيسي لمدة دقيقة واحدة لإزالة المادة الطافية.
أضف 200 ميكرولتر من TCEP خمسة ملليمولار في محلول Tris سعة 50 ملليمولار لإعادة تعليق الخرزات. أضف ميكروجراما واحدا من مزيج التربسين / Lys-C لمدة 14 ساعة عند 1،200 دورة في الدقيقة و 37 درجة مئوية. بعد 14 ساعة ، أضف 0.2 ميكروغرام إضافية من مزيج التربسين / Lys-C لمدة ثلاث ساعات ، وقم بتدوير أنابيب العينة ، وضعها على رف مغناطيسي لمدة دقيقة واحدة.
ثم ، نقل طافت الببتيد إلى الأنابيب النظيفة. بعد ذلك ، اغسل الخرز ب 50 ميكرولترا من محلول Tris سعة 50 ملليمولار مع الاهتزاز لمدة خمس دقائق ، وادمج المواد الطافية الببتيد ، وأضف 30 ميكرولترا من حمض ثلاثي فلورو أسيتيك بنسبة 10٪ إلى الأنبوب لتقليل درجة الحموضة إلى أقل من ثلاثة. بعد تحلية الببتيد والتجفيف.
إعادة تعليق عينات الببتيد في المخزن المؤقت LC لتحليل LC-MS. انقل المادة الطافية إلى قارورة عينة LC لتحليلها باستخدام nano LC-MS. في ملف أسلوب LC-MS، أضف قائمة استبعاد LC-MS مخصصة ذات كتل محددة ونطاقات زمنية للاحتفاظ لقمم الببتيد الملوثة عالية الوفرة، مثل الستربتافيدين والتربسين وLys-C.
تحليل البيانات الأولية LC-MC باستخدام برنامج تحليل بيانات البروتينات. قم بتضمين مكتبتين FASTA قاعدة بيانات مرجعية Swiss-Prot Homo sapiens ، ومكتبة FASTA عالمية للملوثات تم إنشاؤها حديثا مع بادئة ملوثات في معرف UniProt.قم بإعداد معلمات تحليل البيانات بمعدل اكتشاف خاطئ بنسبة 1٪ لتعريفات مطابقة طيف البروتين والببتيد. حدد هضم التربسين مع ثلاثة انقسامات مفقودة ، وتعديل ثابت لمثيلة كارباميديل السيستين ، وتعديل متغير لأكسدة الميثيونين ، وأستلة نهاية البروتين.
من أجل القياس الكمي الخالي من الملصقات ، قم بتطبيع شدة ذروة الببتيد MS-I إلى كربوكسيلاز PCCA البيوتينيل الداخلي وتقليل الاختلافات في تجارب وضع العلامات عن قرب. تصدير نتائج مستوى البروتين من برنامج البروتينات كملف Excel. قبل التحليل الإحصائي ، قم بإزالة البروتينات والبروتينات الملوثة باستخدام PSM واحد فقط أو بدون نتيجة قياس كمي.
أوضحت مورفولوجيا الخلايا في نقاط زمنية مختلفة من الخلايا العصبية iPSC نمو الخلايا العصبية خلال فترة التمايز التي استمرت ثلاثة أيام. بعد التحول إلى الصفائح المطلية ب poly-L-ornithine في وسط الخلايا العصبية ، شكلت الخلايا العصبية شبكة بين الخلايا العصبية وأصبحت الامتدادات المحورية أكثر وضوحا بعد النضج في غضون أسبوعين. في التصوير الفلوري ، تم تلطيخ نشاط قمة LAMP1 للبروتينات البيوتينيل بواسطة الستربتافيدين وشارك في توطينه مع تلطيخ LAMP1 في الخلايا العصبية.
أظهرت نتائج مقايسة معايرة الخرزة انخفاضا في إشارات البروتين البيوتينيل غير الملتقطة عند زيادة كمية حبات الستربتافيدين. كانت خمسة ميكرولترات من حبات الستربتافيدين مثالية ل 50 ميكروغرام من بروتينات المدخلات من عينات قمة LAMP1 الذاتية. أدى الهضم على الخرز مع مزيج التربسين / Lys-C إلى المزيد من تحديد البروتين والببتيد وتقليل الانقسامات الفائتة عند مقارنتها بالتربسين وحده.
بالإضافة إلى ذلك ، تم العثور على 1 إلى 1.5 ميكروغرام من التربسين / Lys-C لتكون مثالية لهضم الخرز للحصول على أكبر عدد من البروتينات المحددة وأقل نسبة من الانقسامات الفائتة. تمت زيادة بروتينات الغشاء الليزوزومي المعروفة في قمة LAMP1 مقابل عدم التحكم في القمة. البروتينات البيوتينيل الذاتية وفيرة للغاية ولكنها تظل دون تغيير.
اقترح تحليل مصطلح GO وشبكة البروتين أن بروتينات الغشاء الليزوزومي المستقرة والتفاعلات الليزوزومية العابرة المتعلقة بالاتجار والنقل داخل الليزوزومات قد تم إثراؤها في البروتينات العليا LAMP1. يجب إخماد وضع العلامات على القرب من Apex في دقيقة واحدة بالضبط لتقليل الإجهاد التأكسدي والاختلافات التجريبية. لقد طورنا مؤخرا طريقة البيوتين القابلة للانقسام والتي تسمح لنا بإثراء البروتينات الحيوية.
هذه الطريقة ، عندما تقترن بطريقتنا الحالية ، ستسمح لنا بتقليل التداخلات من الستربتافيدين والبروتينات الحيوية الذاتية. يمكننا تطبيق هذه الطريقة على كل من الخلايا العصبية البرية والمتحولة ذات المتغيرات الجينية التي تسبب أمراض الدماغ. يمكن أن يساعدنا هذا في فهم كيف ولماذا تؤثر الطفرات الجينية على البيئة المكروية الليزوزومية في الخلايا العصبية البشرية.
