Lizozomlar hücrenin çöp atma sistemleridir. Lizozomal aktiviteler oldukça dinamiktir ve yakalanması çok zordur. Bu çalışmada, canlı insan nöronlarındaki lizozomal mikro çevreyi deşifre etmek için bir yakınlık etiketleme proteomik yaklaşımı geliştirdik.
Bu yaklaşım, lizozom membran proteinlerini ve lizozom ve iPSC türevi nöronlarla kararlı ve geçici etkileşimleri yakalar. Lizozomal disfonksiyon çeşitli beyin hastalıklarında ağır bir şekilde rol oynar. Bu teknik, çeşitli beyin hastalıklarını anlamak ve yeni tedaviler tasarlamak için potansiyel moleküler hedefler sağlamak için uygulanabilir.
Yakınlık etiketleme prosedürüne başlamak için, canlı ve sağlıklı olduklarından emin olmak için nöronları mikroskop altında gözlemleyin. Biotin fenol ile karıştırmak için kültürden yarım hacimli bir ortam alın ve 37 santigrat derece inkübatörde 30 dakika boyunca 500 mikromolar'lık son bir konsantrasyonda nöronlara tekrar ekleyin. Nöron kültürüne bir milimolar nihai konsantrasyonda taze hazırlanmış hidrojen peroksit çözeltisi ekleyerek etiketleme reaksiyonunu başlatın.
Bir dakikalık bir inkübasyondan sonra, ortamı aspire edin ve kültürü söndürme tamponu ile üç kez durulayın. Tüm kalan tamponu aspire etmek için plakayı eğin. Buz gibi soğuk lizis tamponu ekledikten sonra, hücre lizatlarını soğuk 1.5 mililitrelik tüplere kazıyın.
Tüpleri buz gibi soğuk bir su banyosunda 15 dakika boyunca 100 watt'tan fazla bir mesafede, 40 saniyelik alternatif döngülerle ve 20 saniyelik kapalı olarak sonikleştirin. Hücre lizisinden sonra, numuneye eksi 20 santigrat derecede soğuk asetonu, hücre lizat çözeltisinin dört kat hacminde ekleyin. Vorteks kısaca ve proteinleri çökeltmek ve kalıntı biyotin fenol çıkarmak için üç saat boyunca eksi 20 santigrat derecede inkübe edin.
Hücre lizat tüpünü iki santigrat derecede 10 dakika boyunca 16.500 kez G'de santrifüj edin ve protein peletini rahatsız etmeden süpernatantı dikkatlice çıkarın. Daha sonra, peleti eksi 20 santigrat derecede bir mililitre aseton ile iki kez yıkayın, ardından santrifüjleme ve süpernatanın çıkarılması. Daha sonra, protein peletini bir dakika boyunca bir vakum yoğunlaştırıcı ile kurutun.
Peletin vorteks veya sonikasyon ile tamamen çözülmesi için hücre lizis tamponu ekleyin. DCA testi ile toplam protein konsantrasyonunu belirlemek için 20 mikrolitre aliquot alın. Kalan hücre çözeltisini eksi 80 santigrat derecede saklayın.
Protein lizat örneğini eksi 80 santigrat derece dondurucudan alın ve hızlı çözülme için numune tüpünü 30 saniye boyunca sonikleştirin. Girdap, tezgah üstü mini santrifüj ile kısaca santrifüj yapın ve numune tüpünü buzun üzerine yerleştirin. Daha sonra, her 1,5 mililitrelik tüpe 250 mikrolitre streptavidin manyetik boncuk bulamacı aktarın.
Bu tüpleri bir dakika boyunca manyetik bir rafa yerleştirin, boncukları bir mililitre% 2 sodyum dodesil sülfat çözeltisi ile üç kez yıkayın ve kalan tamponu çıkarın. Hücre lizatları toplam protein konsantrasyonuna ve boncuk titrasyon testi sonuçlarına dayanarak, streptavidin manyetik boncuk bulamacının 250 mikrolitresi için gereken hesaplanan protein numunesi miktarını ekleyin. Daha sonra, manyetik boncuk-lizat karışımına bir mikrolitrenin toplam hacmine hücre lizis tamponu ekleyin ve tüpü gece boyunca dört santigrat derecede döndürün.
Ertesi gün, numune tüpünü bir tezgah üstü mikrosantrifüj üzerinde kısa bir süre santrifüj edin ve süpernatanı çıkarmak için tüpü bir dakika boyunca manyetik bir rafa yerleştirin. Ardından, oda sıcaklığında beş dakika rotasyonla bir mililitre yıkama tamponu A kullanarak boncukları iki kez yıkayın. İşlemi her yıkama tamponuyla, B tamponu, C tamponu ve D tamponu ile dört santigrat derecede sırayla iki kez tekrarlayın.
Tüpü bir dakika boyunca manyetik bir rafa yerleştirin ve süpernatanı çıkarın. Daha sonra, boncukları 50 milimolar Tris tamponunda 100 mikrolitre beş milimolar TCEP içinde yeniden askıya alarak 37 santigrat derecede bir termomikser üzerinde 30 dakika kuluçkaya yatırın, ardından karanlıkta 30 dakika boyunca 15 milimolar IAA ilavesi ve kalıntı IAA'yı söndürmek için beş dakika boyunca beş milimolar TCEP ilavesi yapın. Numune tüpünü bir mikrosantrifüj üzerinde kısaca santrifüj yapın ve süpernatanı çıkarmak için tüpü bir dakika boyunca manyetik bir rafa yerleştirin.
Boncukları yeniden askıya almak için 50 milimolar Tris tamponuna 200 mikrolitre beş milimolar TCEP ekleyin. 1, 200 RPM ve 37 santigrat derecede 14 saat boyunca bir mikrogram tripsin / Lys-C karışımı ekleyin. 14 saat sonra, üç saat boyunca ilave 0.2 mikrogram tripsin / Lys-C karışımı ekleyin, numune tüplerini döndürün ve bir dakika boyunca manyetik bir rafa koyun.
Daha sonra, peptid süpernatantını temiz tüplere aktarın. Daha sonra, boncukları beş dakika boyunca sallayarak 50 mikrolitre 50 milimolar Tris tamponu ile yıkayın, peptid süpernatantlarını birleştirin ve pH'ı üçten daha azına düşürmek için tüpe 30 mikrolitre% 10 trifloroasetik asit ekleyin. Peptit tuzdan arındırıldıktan ve kurutulduktan sonra.
LC-MS analizi için LC tamponundaki peptid örneklerini yeniden askıya alın. Nano LC-MS ile analiz etmek için süpernatantı LC numune şişesine aktarın. LC-MS yöntem dosyasında, streptavidin, tripsin ve Lys-C gibi oldukça bol miktarda kirletici peptid pikleri için belirli kütlelere ve bekletme zaman aralıklarına sahip özel bir LC-MS dışlama listesi ekleyin.
LC-MC ham verilerini proteomik veri analiz yazılımı ile analiz edin. İki FASTA kütüphanesi bir Swiss-Prot Homo sapiens referans veritabanı ve UniProt ID'de bir kirletici öneki olan yeni oluşturulmuş bir evrensel kirletici FASTA kütüphanesi ekleyin.Protein ve peptid spektral eşleştirme tanımlamaları için% 1 yanlış keşif oranı ile veri analizi parametrelerini ayarlayın. Üç kaçırılmış bölünme, sistin karbamidil metilasyonunun sabit bir modifikasyonu, metiyonin oksidasyonunun değişken bir modifikasyonu ve protein son terminal asetilasyonu ile tripsin sindirimini seçin.
Etiketsiz niceleme için, peptid MS-I pik yoğunluklarını endojen biyotinillenmiş karboksilaz PCCA'ya normalleştirin ve yakınlık etiketleme deneylerindeki varyasyonları azaltın. Proteomik yazılımından protein seviyesi sonuçlarını Excel dosyası olarak dışa aktarın. İstatistiksel analizden önce, kirletici proteinleri ve proteinleri sadece bir PSM ile veya hiçbir niceleme sonucu olmadan çıkarın.
iPSC nöronlarının farklı zaman noktalarındaki hücre morfolojileri, üç günlük farklılaşma döneminde nörit büyümesini gösterdi. Nöron ortamında poli-L-ornitin kaplı plakalara geçtikten sonra, nöritler nöronlar arasında bir ağ oluşturdu ve aksonal uzantılar iki hafta içinde olgunlaşmadan sonra daha görünür hale geldi. Floresan görüntülemede, biyotinile proteinlerin LAMP1 apeks aktivitesi streptavidin ile boyandı ve nöronlarda LAMP1 boyaması ile birlikte lokalize edildi.
Boncuk titrasyon testinin sonuçları, streptavidin boncuk miktarını arttırırken yakalanmamış biyotinile protein sinyallerinin azaldığını göstermiştir. Beş mikrolitre streptavidin boncuğu, endojen LAMP1 tepe örneklerinden 50 mikrogram giriş proteini için en uygunuydu. Tripsin / Lys-C karışımı ile boncuk üzerindeki sindirim, tek başına tripsin ile karşılaştırıldığında daha fazla protein ve peptit tanımlaması ve daha az kaçırılmış bölünme ile sonuçlandı.
Ek olarak, 1 ila 1.5 mikrogram tripsin / Lys-C'nin, en yüksek sayıda tanımlanmış protein ve kaçırılan bölünmelerin en düşük yüzdesini elde etmek için boncuk üzerindeki sindirim için en uygun olduğu bulunmuştur. Bilinen lizozomal membran proteinleri LAMP1 apeksinde artmış, ancak tepe kontrolü yapılmamıştır. Endojen olarak biyotinile proteinler oldukça bol miktarda bulunur, ancak değişmeden kalır.
GO terimi ve protein ağı analizi, stabil lizozomal membran proteinlerinin ve endolizozomal kaçakçılık ve transportla ilişkili geçici lizozomal interaktörlerin LAMP1 apeks proteomiklerinde zenginleştirildiğini göstermiştir. Apex yakınlık etiketlemesi, oksidatif stresi ve deneysel varyasyonları azaltmak için tam olarak bir dakikada söndürülmelidir. Son zamanlarda biyotinile proteinleri zenginleştirmemizi sağlayan bölünebilir bir biyotin yöntemi geliştirdik.
Bu yöntem, mevcut yöntemimizle birleştirildiğinde, streptavidin ve endojen olarak biyotinile proteinlerden gelen parazitleri azaltmamıza izin verecektir. Bu yöntemi beyin hastalıklarına neden olan genetik varyantları olan hem vahşi tip hem de mutant nöronlara uygulayabiliriz. Bu, genetik mutasyonların insan nöronlarındaki lizozomal mikro çevreyi nasıl ve neden etkilediğini anlamamıza yardımcı olabilir.
