Лизосомы - это системы утилизации мусора в клетке. Лизосомальная деятельность очень динамична и ее очень трудно уловить. В этом исследовании мы разработали подход протеомики с бесконтактной маркировкой для расшифровки лизосомального микроокружения в живых нейронах человека.
Этот подход захватывает белки мембраны лизосомы и стабильные и переходные взаимодействия с лизосомами и нейронами, полученными из iPSC. Лизосомальная дисфункция в значительной степени связана с различными заболеваниями головного мозга. Этот метод может быть применен для понимания различных заболеваний головного мозга и предоставления потенциальных молекулярных целей для разработки новых методов лечения.
Чтобы начать процедуру бесконтактной маркировки, понаблюдайте за нейронами под микроскопом, чтобы убедиться, что они живы и здоровы. Возьмите половину объема среды из культуры, чтобы смешать с фенолом биотина и добавить его обратно к нейронам в конечной концентрации 500 микромоляров в течение 30 минут в инкубаторе с температурой 37 градусов Цельсия. Инициировать реакцию маркировки путем добавления свежеприготовленного раствора перекиси водорода в культуру нейронов в конечной концентрации в одномиллимолярной.
После одноминутной инкубации аспирировать среду и трижды промыть культуру буфером закалки. Наклоните пластину, чтобы аспирировать весь остаточный буфер. После добавления ледяного буфера лизиса соскоблите лизаты клеток в холодные 1,5-миллилитровые трубки.
Обработайте ультразвуком трубки на ледяной водяной бане мощностью более 100 Вт в течение 15 минут с чередующимися циклами включения 40 секунд и 20 секунд выключения. После лизиса клеток добавляют холодный ацетон при минус 20 градусах Цельсия в образец при четырехкратном объеме раствора клеточного лизата. Вихрь ненадолго и инкубируют при минус 20 градусах Цельсия в течение трех часов, чтобы осаждать белки и удалять остатки фенола биотина.
Центрифугируют клеточную лизатную трубку в 16 500 раз G в течение 10 минут при двух градусах Цельсия и осторожно удаляют супернатант, не нарушая белковую гранулу. Затем дважды промыть гранулу одним миллилитром ацетона при минус 20 градусах Цельсия с последующим центрифугированием и удалением супернатанта. Далее высушите белковую гранулу вакуумным концентратором в течение одной минуты.
Добавьте буфер лизиса клеток, чтобы полностью растворить гранулу с помощью вихря или обработки ультразвуком. Возьмите 20 микролитров аликвоты, чтобы определить общую концентрацию белка с помощью анализа DCA. Хранить оставшийся клеточный раствор при минус 80 градусах Цельсия.
Возьмите образец лизата белка из морозильной камеры с температурой минус 80 градусов по Цельсию и обработайте пробирку ультразвуком в течение 30 секунд для быстрого оттаивания. Вихрь, центрифуга ненадолго с настольной мини-центрифугой и поместите пробочку на лед. Затем переложите 250 микролитров магнитной шариковой суспензии стрептавидина на каждую 1,5-миллилитровую трубку.
Поместите эти трубки на магнитную стойку на одну минуту, трижды вымойте шарики одним миллилитром 2% раствора додецилсульфата натрия и удалите остаточный буфер. Основываясь на общей концентрации белка лизатов клеток и результатах анализа титрования шариков, добавьте расчетное количество образца белка, необходимое для 250 микролитров магнитной шариковой суспензии стрептавидина. Затем добавьте буфер лизиса клеток к магнитной бисерно-лизатной смеси до общего объема одного микролитра и поверните трубку на ночь при четырех градусах Цельсия.
На следующий день ненадолго центрифугируйте пробирку на настольной микроцентрифуге и поместите трубку на магнитную стойку на одну минуту, чтобы удалить супернатант. Затем дважды вымойте бусины, используя один миллилитр промывочного буфера А с пятью минутами вращения при комнатной температуре. Повторите процесс с каждым буфером промывки дважды, последовательно, с буфером B, буфером C и буфером D при четырех градусах Цельсия.
Поместите трубку на магнитную стойку на одну минуту и извлеките супернатант. Затем повторно суспендируют шарики в 100 микролитрах пятимиллимолярного TCEP в 50-миллимолярном буфере Tris для инкубации в течение 30 минут на термомиксоре при 37 градусах Цельсия, с последующим добавлением 15-миллимолярного IAA в течение 30 минут в темноте и добавлением пятимиллимолилярного TCEP в течение пяти минут для гашения остатка IAA. Ненадолго центрифугируйте пробирку на микроцентрифуге и поместите трубку на магнитную стойку на одну минуту, чтобы удалить супернатант.
Добавьте 200 микролитров пятимиллимолярного TCEP в 50-миллимолярный буфер Tris, чтобы повторно суспендировать шарики. Добавьте один микрограмм смеси трипсина/Lys-C в течение 14 часов при 1 200 об/мин и 37 градусах Цельсия. Через 14 часов добавьте дополнительные 0,2 микрограмма смеси трипсина / Lys-C в течение трех часов, раскрутите пробирки для образцов и положите их на магнитную стойку на одну минуту.
Затем перенесите пептидный супернатант в чистые трубки. Затем промыть бусины 50 микролитрами 50-миллимолярного буфера Триса с встряхиванием в течение пяти минут, соединить пептидные супернатанты и добавить в трубку 30 микролитров 10% трифторуксусной кислоты, чтобы снизить рН до менее трех. После обессоливания и высыхания пептидов.
повторное суспендирование пептидных образцов в LC-буфере для анализа LC-MS. Перенесите супернатант во флакон с образцом LC для анализа с помощью нано LC-MS. В файле метода LC-MS добавьте пользовательский список исключений LC-MS с конкретными массами и диапазонами времени удержания для высокообильных пиков загрязняющих пептидов, таких как стрептавидин, трипсин и Lys-C.
Анализируйте необработанные данные LC-MC с помощью программного обеспечения для анализа данных протеомики. Включите две библиотеки FASTA: справочную базу данных Swiss-Prot Homo sapiens и недавно созданную универсальную библиотеку загрязняющих веществ FASTA с префиксом загрязняющих веществ в Идентификаторе UniProt.Настройте параметры анализа данных с коэффициентом ложного обнаружения 1% для идентификации спектрального соответствия белка и пептида. Выберите переваривание трипсина с тремя пропущенными расщеплениями, фиксированной модификацией метилирования цистина карбамидила, переменной модификацией окисления метионина и концевым ацетилированием белка.
Для количественной оценки без маркировки нормализуйте пиковые интенсивности пептида MS-I до эндогенно биотинилированной карбоксилазы PCCA и уменьшите вариации в экспериментах по бесконтактной маркировке. Экспортируйте результаты уровня белка из программного обеспечения протеомики в виде файла Excel. Перед статистическим анализом удалите загрязняющие белки и белки только с одним PSM или без результата количественной оценки.
Морфология клеток в разные моменты времени нейронов iPSC проиллюстрировала рост нейритов в течение трехдневного периода дифференцировки. После перехода на поли-L-орнитин-покрытые пластины в нейронной среде, нейриты образовали сеть между нейронами и аксональные расширения стали более заметными после созревания через две недели. В флуоресцентной визуализации верхушечная активность биотинилированных белков LAMP1 была окрашена стрептавидином и совместно локализована с окрашиванием LAMP1 в нейронах.
Результаты анализа титрования шариков продемонстрировали снижение неохваченных сигналов биотинилированного белка при увеличении количества шариков стрептавидина. Пять микролитров бусин стрептавидина были оптимальными для 50 микрограммов входных белков из эндогенных образцов LAMP1. Переваривание бисера смесью трипсина / Lys-C привело к большему количеству идентификации белка и пептидов и меньшему количеству пропущенных расщеплений по сравнению с одним только трипсином.
Кроме того, было установлено, что от 1 до 1,5 микрограммов трипсина / Lys-C являются оптимальными для пищеварения на шариках, чтобы получить наибольшее количество идентифицированных белков и самый низкий процент пропущенных расщеплений. Известные лизосомальные мембранные белки были увеличены в LAMP1 по сравнению с отсутствием контроля вершины. Эндогенно биотинилированные белки очень распространены, но остаются неизменными.
Термин GO и анализ белковой сети показали, что стабильные лизосомальные мембранные белки и переходные лизосомальные интеракторы, связанные с эндолизосомальным трафиком и транспортом, были обогащены апекс-протеомикой LAMP1. Бесконтактная маркировка Apex должна быть заглушена ровно в одну минуту, чтобы уменьшить окислительный стресс и экспериментальные вариации. Недавно мы разработали расщепляемый метод биотина, который позволяет нам обогащать биотинилированные белки.
Этот метод, в сочетании с нашим текущим методом, позволит нам уменьшить помехи от стрептавидина и эндогенно биотинилированных белков. Мы можем применить этот метод как к диким, так и к мутантным нейронам с генетическими вариантами, вызывающими заболевания головного мозга. Это может помочь нам понять, как и почему генетические мутации влияют на лизосомальную микросреду в нейронах человека.
