Les lysosomes sont les systèmes d’élimination des ordures de la cellule. Les activités lysosomales sont très dynamiques et très difficiles à capturer. Dans cette étude, nous avons développé une approche protéomique de marquage de proximité pour déchiffrer le microenvironnement lysosomal dans les neurones humains vivants.
Cette approche capture les protéines membranaires du lysosome et les interactions stables et transitoires avec les neurones dérivés du lysosome et de l’iPSC. Le dysfonctionnement lysosomal est fortement impliqué dans diverses maladies du cerveau. Cette technique peut être appliquée pour comprendre diverses maladies du cerveau et fournir des cibles moléculaires potentielles pour concevoir de nouvelles thérapies.
Pour commencer la procédure d’étiquetage de proximité, observez les neurones au microscope pour vous assurer qu’ils sont vivants et en bonne santé. Prenez un demi-volume de milieu de la culture pour le mélanger avec du phénol de biotine et ajoutez-le aux neurones à une concentration finale de 500 micromolaires pendant 30 minutes dans un incubateur à 37 degrés Celsius. Initier la réaction de marquage en ajoutant une solution de peroxyde d’hydrogène fraîchement préparée dans la culture de neurones à une concentration finale d’un millimolaire.
Après une incubation d’une minute, aspirer le milieu et rincer la culture trois fois avec un tampon de trempe. Inclinez la plaque pour aspirer tout le tampon résiduel. Après avoir ajouté un tampon de lyse glacé, grattez les lysats cellulaires dans des tubes froids de 1,5 millilitre.
Soniquez les tubes dans un bain-marie glacé à plus de 100 watts pendant 15 minutes avec des cycles alternés de 40 secondes allumés et 20 secondes éteints. Après la lyse cellulaire, ajouter de l’acétone froide à moins 20 degrés Celsius à l’échantillon à un volume quatre fois supérieur à celui de la solution de lysat cellulaire. Vortex brièvement et incuber à moins 20 degrés Celsius pendant trois heures pour précipiter les protéines et éliminer les résidus de biotine phénol.
Centrifuger le tube de lysat cellulaire à 16, 500 fois G pendant 10 minutes à deux degrés Celsius et retirer soigneusement le surnageant sans perturber la pastille de protéine. Ensuite, lavez la pastille deux fois avec un millilitre d’acétone à moins 20 degrés Celsius, puis par centrifugation et élimination du surnageant. Ensuite, séchez la pastille de protéine avec un concentrateur sous vide pendant une minute.
Ajouter un tampon de lyse cellulaire pour dissoudre complètement la pastille avec vortex ou sonication. Prélever 20 microlitres d’aliquote pour déterminer la concentration totale de protéines par le dosage du DCA. Conservez la solution cellulaire restante à moins 80 degrés Celsius.
Prélevez l’échantillon de lysat de protéines du congélateur à moins 80 degrés Celsius et soniquez le tube d’échantillon pendant 30 secondes pour une décongélation rapide. Vortex, centrifuger brièvement avec une mini-centrifugeuse de paillasse et placer le tube d’échantillon sur de la glace. Ensuite, transférez 250 microlitres de boue magnétique de billes de streptavidine dans chaque tube de 1,5 millilitre.
Placez ces tubes sur une grille magnétique pendant une minute, lavez les billes trois fois avec un millilitre de solution de dodécylsulfate de sodium à 2% et retirez le tampon résiduel. Sur la base de la concentration totale en protéines des lysats cellulaires et des résultats du test de titrage des billes, ajoutez la quantité calculée d’échantillon de protéines nécessaire pour 250 microlitres de la suspension magnétique de billes de streptavidine. Ensuite, ajoutez un tampon de lyse cellulaire au mélange perle-lysat magnétique au volume total d’un microlitre et faites tourner le tube pendant la nuit à quatre degrés Celsius.
Le lendemain, centrifugez brièvement le tube d’échantillon sur une microcentrifugeuse de paillasse et placez le tube sur un support magnétique pendant une minute pour retirer le surnageant. Ensuite, lavez les billes deux fois en utilisant un millilitre de tampon de lavage A avec cinq minutes de rotation à température ambiante. Répétez le processus avec chaque tampon de lavage deux fois, séquentiellement, avec le tampon B, le tampon C et le tampon D à quatre degrés Celsius.
Placez le tube sur une grille magnétique pendant une minute et retirez le surnageant. Ensuite, remettre les billes en suspension dans 100 microlitres de PTCE à cinq millimolaires dans un tampon Tris de 50 millimolaires pour incuber pendant 30 minutes sur un thermomélangeur à 37 degrés Celsius, suivi d’un ajout d’IAA de 15 millimolaires pendant 30 minutes dans l’obscurité et d’un ajout de PTCE de cinq millimolaires pendant cinq minutes pour éteindre les résidus d’AAA. Centrifuger brièvement le tube d’échantillon sur une microcentrifugeuse et placer le tube sur une grille magnétique pendant une minute pour éliminer le surnageant.
Ajouter 200 microlitres de PTCE à cinq millimolaires dans un tampon Tris de 50 millimolaires pour remettre les billes en suspension. Ajouter un microgramme de mélange trypsine/Lys-C pendant 14 heures à 1 200 tr/min et 37 degrés Celsius. Après 14 heures, ajoutez 0,2 microgramme supplémentaire de mélange trypsine/Lys-C pendant trois heures, faites tourner les tubes d’échantillon et placez-les sur une grille magnétique pendant une minute.
Ensuite, transférez le surnageant peptidique dans les tubes propres. Ensuite, lavez les billes avec 50 microlitres de tampon Tris 50 millimolaires en agitant pendant cinq minutes, combinez les surnageants peptidiques et ajoutez 30 microlitres d’acide trifluoroacétique à 10% dans le tube pour réduire le pH à moins de trois. Après dessalage et séchage des peptides.
remettre en suspension les échantillons de peptides dans un tampon LC pour l’analyse LC-MS. Transférer le surnageant dans le flacon d’échantillon LC pour l’analyser avec nano LC-MS. Dans le fichier de méthode LC-MS, ajoutez une liste d’exclusion LC-MS personnalisée avec des masses et des plages de temps de rétention spécifiques pour les pics de peptides contaminants très abondants, tels que la streptavidine, la trypsine et Lys-C.
Analysez les données brutes LC-MC avec un logiciel d’analyse de données protéomique. Incluez deux bibliothèques FASTA, une base de données de référence Swiss-Prot Homo sapiens et une nouvelle bibliothèque universelle de contaminants FASTA avec un préfixe de contaminant dans l’ID UniProt.Configurez les paramètres d’analyse des données avec un taux de fausse découverte de 1% pour les identifications spectrales de protéines et de peptides. Sélectionnez la digestion de la trypsine avec trois clivages manqués, une modification fixe de la méthylation de la cystine carbamidyle, une modification variable de l’oxydation de la méthionine et une acétylation terminale des protéines.
Pour une quantification sans marquage, normaliser les intensités maximales du peptide MS-I à la carboxylase PCCA biotinylée endogène et réduire les variations dans les expériences de marquage de proximité. Exportez les résultats du niveau de protéines du logiciel de protéomique sous forme de fichier Excel. Avant l’analyse statistique, éliminer les protéines contaminantes et les protéines avec un seul PSM ou aucun résultat de quantification.
Les morphologies cellulaires à différents points temporels des neurones iPSC ont illustré la croissance des neurites au cours de la période de différenciation de trois jours. Après être passés à des plaques recouvertes de poly-L-ornithine dans le milieu neuronal, les neurites ont formé un réseau entre les neurones et les extensions axonales sont devenues plus visibles après la maturation en deux semaines. Dans l’imagerie par fluorescence, l’activité apex LAMP1 des protéines biotinylées a été colorée par la streptavidine et co-localisée avec la coloration LAMP1 dans les neurones.
Les résultats de l’essai de titrage des billes ont démontré un déclin des signaux de protéines biotinylées non capturés lors de l’augmentation de la quantité de billes de streptavidine. Cinq microlitres de billes de streptavidine étaient optimaux pour 50 microgrammes de protéines d’entrée provenant d’échantillons endogènes LAMP1 apex. La digestion sur les billes avec le mélange trypsine/Lys-C a entraîné plus d’identifications de protéines et de peptides et moins de clivages manqués par rapport à la trypsine seule.
De plus, 1 à 1,5 microgramme de trypsine/Lys-C s’est avéré optimal pour la digestion sur les billes afin d’obtenir le plus grand nombre de protéines identifiées et le plus faible pourcentage de clivages manqués. Les protéines membranaires lysosomales connues ont augmenté dans l’apex LAMP1 par rapport à l’absence de contrôle apex. Les protéines biotinylées de manière endogène sont très abondantes mais restent inchangées.
L’analyse du terme GO et du réseau de protéines a suggéré que les protéines membranaires lysosomales stables et les interacteurs lysosomales transitoires liés au trafic et au transport endolysosomales étaient enrichis dans la protéomique de l’apex LAMP1. L’étiquetage de proximité Apex doit être éteint à exactement une minute pour réduire le stress oxydatif et les variations expérimentales. Nous avons récemment développé une méthode de biotine clivable qui nous permet d’enrichir les protéines biotinylées.
Cette méthode, combinée à notre méthode actuelle, nous permettra de réduire les interférences de la streptavidine et des protéines biotinylées endogènes. Nous pouvons appliquer cette méthode aux neurones de type sauvage et mutants avec des variantes génétiques qui causent des maladies du cerveau. Cela peut nous aider à comprendre comment et pourquoi les mutations génétiques influencent le microenvironnement lysosomal dans les neurones humains.
