I lisosomi sono i sistemi di smaltimento dei rifiuti della cellula. Le attività lisosomiali sono altamente dinamiche e molto difficili da catturare. In questo studio, abbiamo sviluppato un approccio proteomico di marcatura di prossimità per decifrare il microambiente lisosomiale nei neuroni umani vivi.
Questo approccio cattura le proteine di membrana del lisosoma e le interazioni stabili e transitorie con i neuroni derivati dal lisosoma e dalle iPSC. La disfunzione lisosomiale è fortemente implicata in varie malattie del cervello. Questa tecnica può essere applicata per comprendere varie malattie del cervello e fornire potenziali bersagli molecolari per progettare nuove terapie.
Per iniziare la procedura per l'etichettatura di prossimità, osservare i neuroni al microscopio per assicurarsi che siano vivi e sani. Prendi un mezzo volume di terreno dalla coltura per mescolarlo con biotina fenolo e aggiungilo ai neuroni ad una concentrazione finale di 500 micromolari per 30 minuti in un incubatore a 37 gradi Celsius. Avviare la reazione di etichettatura aggiungendo una soluzione di perossido di idrogeno appena preparata nella coltura di neuroni a concentrazione finale di un millimolare.
Dopo un'incubazione di un minuto, aspirare il mezzo e risciacquare la coltura tre volte con tampone temprante. Inclinare la piastra per aspirare tutto il tampone residuo. Dopo aver aggiunto il tampone di lisi ghiacciato, raschiare i lisati cellulari in tubi freddi da 1,5 millilitri.
Sonicare i tubi in un bagno di acqua ghiacciata a più di 100 watt per 15 minuti con cicli alternati di 40 secondi accesi e 20 secondi spenti. Dopo la lisi cellulare, aggiungere acetone freddo a meno 20 gradi Celsius al campione ad un volume quattro volte superiore della soluzione di lisato cellulare. Vortice brevemente e incubare a meno 20 gradi Celsius per tre ore per precipitare le proteine e rimuovere i residui di biotina fenolo.
Centrifugare il tubo di lisato cellulare a 16, 500 volte G per 10 minuti a due gradi Celsius e rimuovere con attenzione il surnatante senza disturbare il pellet proteico. Quindi, lavare il pellet due volte con un millilitro di acetone a meno 20 gradi Celsius, seguito da centrifugazione e rimozione del surnatante. Quindi, asciugare il pellet proteico con un concentratore sottovuoto per un minuto.
Aggiungere tampone di lisi cellulare per sciogliere completamente il pellet con vortice o sonicazione. Prelevare 20 microlitri di aliquota per determinare la concentrazione totale di proteine mediante il test DCA. Conservare la soluzione cellulare rimanente a meno 80 gradi Celsius.
Prelevare il campione di lisato proteico dal congelatore a meno 80 gradi Celsius e sonicare la provetta per 30 secondi per uno scongelamento rapido. Vortex, centrifugare brevemente con una mini centrifuga da banco e posizionare la provetta sul ghiaccio. Quindi, trasferire 250 microlitri di liquame magnetico di streptavidina su ciascun tubo da 1,5 millilitri.
Posizionare questi tubi su un rack magnetico per un minuto, lavare le perle tre volte con un millilitro di soluzione di dodecilsolfato di sodio al 2% e rimuovere il tampone residuo. Sulla base della concentrazione proteica totale dei lisati cellulari e dei risultati del test di titolazione delle sfere, aggiungere la quantità calcolata di campione proteico necessaria per 250 microlitri del liquame magnetico della streptavidina. Quindi, aggiungere il tampone di lisi cellulare alla miscela magnetica perla-lisato al volume totale di un microlitro e ruotare il tubo durante la notte a quattro gradi Celsius.
Il giorno successivo, centrifugare brevemente la provetta su una microcentrifuga da banco e posizionare la provetta su un rack magnetico per un minuto per rimuovere il surnatante. Quindi, lavare le perline due volte utilizzando un millilitro di tampone di lavaggio A con cinque minuti di rotazione a temperatura ambiente. Ripetere il processo con ogni tampone di lavaggio due volte, in sequenza, con buffer B, buffer C e buffer D a quattro gradi Celsius.
Posizionare il tubo su un rack magnetico per un minuto e rimuovere il surnatante. Quindi, risospendere le perle in 100 microlitri di TCEP a cinque millimolari in tampone Tris da 50 millimolari per incubare per 30 minuti su un termomiscelatore a 37 gradi Celsius, seguita da un'aggiunta di IAA di 15 millimolari per 30 minuti al buio e un'aggiunta di TCEP di cinque millimolari per cinque minuti per estinguere i residui IAA. Centrifugare brevemente la provetta su una microcentrifuga e posizionare la provetta su una cremagliera magnetica per un minuto per rimuovere il surnatante.
Aggiungere 200 microlitri di TCEP da cinque millimolari nel tampone Tris da 50 millimolari per risospendere le perle. Aggiungere un microgrammo di miscela tripsina/Lys-C per 14 ore a 1.200 RPM e 37 gradi Celsius. Dopo 14 ore, aggiungere altri 0,2 microgrammi di miscela tripsina/Lys-C per tre ore, far girare le provette e metterle su un rack magnetico per un minuto.
Quindi, trasferire il supernatante peptidico nei tubi puliti. Quindi, lavare le perle con 50 microlitri di tampone Tris da 50 millimolari agitando per cinque minuti, combinare i supernatanti peptidici e aggiungere 30 microlitri di acido trifluoroacetico al 10% al tubo per ridurre il pH a meno di tre. Dopo la desalinizzazione e l'essiccazione del peptide.
risospendere i campioni di peptide nel tampone LC per l'analisi LC-MS. Trasferire il surnatante nel flaconcino del campione LC per analizzarlo con nano LC-MS. Nel file del metodo LC-MS, aggiungere un elenco di esclusione LC-MS personalizzato con masse specifiche e intervalli di tempo di ritenzione per picchi di peptidi contaminanti altamente abbondanti, come streptavidina, tripsina e Lys-C.
Analizza i dati grezzi LC-MC con il software di analisi dei dati di proteomica. Includere due librerie FASTA, un database di riferimento Homo sapiens Swiss-Prot e una libreria FASTA di contaminanti universali di nuova costruzione con un prefisso contaminante nell'ID UniProt.Impostare i parametri di analisi dei dati con un tasso di scoperta falsa dell'1% per le identificazioni di corrispondenza spettrale di proteine e peptidi. Selezionare la digestione della tripsina con tre scissioni mancate, una modifica fissa della metilazione della cistina carbamidil, una modifica variabile dell'ossidazione della metionina e l'acetilazione terminale delle proteine.
Per una quantificazione label-free, normalizzare le intensità di picco del peptide MS-I alla carbossilasi biogena biotinilata PCCA e ridurre le variazioni negli esperimenti di marcatura di prossimità. Esportare i risultati del livello proteico dal software di proteomica come file Excel. Prima dell'analisi statistica, rimuovere le proteine contaminanti e le proteine con un solo PSM o nessun risultato di quantificazione.
Le morfologie cellulari in diversi punti temporali dei neuroni iPSC hanno illustrato la crescita dei neuriti durante il periodo di differenziazione di tre giorni. Dopo il passaggio a piastre rivestite di poli-L-ornitina nel mezzo neuronale, i neuriti formavano una rete tra i neuroni e le estensioni assonali diventavano più visibili dopo la maturazione in due settimane. Nell'imaging a fluorescenza, l'attività dell'apice LAMP1 delle proteine biotinilate è stata colorata dalla streptavidina e co-localizzata con la colorazione LAMP1 nei neuroni.
I risultati del test di titolazione delle sfere hanno dimostrato un declino dei segnali proteici biotinilati non catturati quando si aumenta la quantità di perle di streptavidina. Cinque microlitri di perle di streptavidina erano ottimali per 50 microgrammi di proteine in ingresso da campioni endogeni di apice LAMP1. La digestione on-beads con la miscela tripsina/Lys-C ha portato a più identificazioni di proteine e peptidi e meno scissioni mancate rispetto alla sola tripsina.
Inoltre, da 1 a 1,5 microgrammi di tripsina/Lys-C sono risultati ottimali per la digestione on-beads per ottenere il maggior numero di proteine identificate e la più bassa percentuale di scissioni mancate. Le proteine di membrana lisosomiale note sono aumentate nell'apice di LAMP1 rispetto a nessun controllo dell'apice. Le proteine biotinilate endogenamente sono molto abbondanti ma rimangono invariate.
L'analisi del termine GO e della rete proteica ha suggerito che le proteine stabili della membrana lisosomiale e gli interattori lisosomiali transitori correlati al traffico e al trasporto endolisosomiale sono stati arricchiti nella proteomica dell'apice LAMP1. L'etichettatura di prossimità Apex deve essere spenta esattamente in un minuto per ridurre lo stress ossidativo e le variazioni sperimentali. Abbiamo recentemente sviluppato un metodo di biotina cleavable che ci permette di arricchire le proteine biotinilate.
Questo metodo, se combinato con il nostro metodo attuale, ci permetterà di ridurre le interferenze della streptavidina e delle proteine biotinilate endogenamente. Possiamo applicare questo metodo sia ai neuroni wild-type che a quelli mutanti con varianti genetiche che causano malattie cerebrali. Questo può aiutarci a capire come e perché le mutazioni genetiche influenzano il microambiente lisosomiale nei neuroni umani.
