리소좀은 세포의 쓰레기 처리 시스템입니다. 리소좀 활동은 매우 역동적이며 포착하기가 매우 어렵습니다. 이 연구에서 우리는 살아있는 인간 뉴런에서 리소좀 미세 환경을 해독하기 위한 근접 라벨링 단백질체학 접근 방식을 개발했습니다.
이 접근법은 리소좀 막 단백질과 리소좀 및 iPSC 유래 뉴런과의 안정적이고 일시적인 상호 작용을 포착합니다. 리소좀 기능 장애는 다양한 뇌 질환과 크게 관련이 있습니다. 이 기술은 다양한 뇌 질환을 이해하고 새로운 치료법을 설계하기 위한 잠재적인 분자 표적을 제공하는 데 적용될 수 있습니다.
근접 라벨링 절차를 시작하려면 현미경으로 뉴런을 관찰하여 살아 있고 건강한지 확인하십시오. 배양액에서 절반 부피의 배지를 취하여 비오틴 페놀과 혼합하고 섭씨 37도 인큐베이터에서 30분 동안 최종 농도 500마이크로몰로 뉴런에 다시 추가합니다. 새로 준비된 과산화수소 용액을 1 밀리몰 최종 농도로 뉴런 배양에 첨가하여 표지 반응을 시작합니다.
1분 배양 후, 배지를 흡인하고 퀀치 완충액으로 배양물을 3회 헹굽니다. 플레이트를 기울여 모든 잔류 버퍼를 흡입합니다. 얼음처럼 차가운 용해 완충액을 첨가한 후, 세포 용해물을 차가운 1.5밀리리터 튜브에 긁어낸다.
얼음처럼 차가운 수조에서 튜브를 100와트 이상으로 15분 동안 40초 켜고 20초 끄기의 교대 주기로 초음파 처리합니다. 세포 용해 후, 섭씨 영하 20도의 차가운 아세톤을 세포 용해물 용액의 4배 부피로 샘플에 첨가합니다. 와동을 잠시 하고 섭씨 영하 20도에서 3시간 동안 배양하여 단백질을 침전시키고 잔류물 비오틴 페놀을 제거합니다.
세포 용해물 튜브를 섭씨 2도에서 10분 동안 16, 500배 G로 원심분리하고 단백질 펠렛을 방해하지 않고 상층액을 조심스럽게 제거합니다. 그런 다음 섭씨 영하 20도에서 아세톤 1밀리리터로 펠릿을 두 번 세척한 다음 원심분리하여 상층액을 제거합니다. 다음으로, 단백질 펠릿을 진공 농축기로 1분 동안 건조시킨다.
와류 또는 초음파 처리로 펠릿을 완전히 용해시키기 위해 세포 용해 버퍼를 추가하십시오. 20 마이크로 리터의 부분 표본을 취하여 DCA 분석으로 총 단백질 농도를 측정하십시오. 남은 세포 용액은 섭씨 영하 80도에서 보관하십시오.
섭씨 영하 80도 냉동고에서 단백질 용해물 샘플을 채취하고 빠른 해동을 위해 샘플 튜브를 30초 동안 초음파 처리합니다. 소용돌이, 벤치탑 미니 원심분리기로 잠시 원심분리하고 샘플 튜브를 얼음 위에 놓습니다. 다음으로, 250 마이크로 리터의 스트렙 타비딘 마그네틱 비드 슬러리를 각 1.5 밀리리터 튜브로 옮깁니다.
이 튜브를 마그네틱 랙에 1 분 동안 놓고 2 % 나트륨 도데 실 설페이트 용액 1 밀리리터로 비드를 3 번 씻고 잔류 완충액을 제거합니다. 세포 용해물의 총 단백질 농도 및 비드 적정 분석 결과에 기초하여, 250 마이크로리터의 스트렙타비딘 마그네틱 비드 슬러리에 필요한 단백질 샘플의 계산된 양을 첨가한다. 그런 다음 세포 용해 버퍼를 1 마이크로 리터의 총 부피로 자성 비드-용해물 혼합물에 추가하고 섭씨 4도에서 밤새 튜브를 회전시킵니다.
다음날, 벤치탑 미세 원심분리기에서 샘플 튜브를 잠시 원심분리하고 튜브를 마그네틱 랙에 1분 동안 놓아 상청액을 제거합니다. 이어서, 비드를 실온에서 5분간 회전시키면서 1밀리리터의 세척 완충액 A를 사용하여 2회 세척한다. 각 세척 버퍼로 섭씨 4도에서 버퍼 B, 버퍼 C 및 버퍼 D를 사용하여 순차적으로 두 번 프로세스를 반복합니다.
튜브를 마그네틱 랙에 1 분 동안 놓고 상층액을 제거하십시오. 이어서, 비드를 50밀리몰 트리스 완충액 중 100마이크로리터의 5밀리몰 TCEP에 재현탁시켜 섭씨 37도의 열혼합기에서 30분 동안 인큐베이션한 다음, 어둠 속에서 30분 동안 15밀리몰 IAA를 첨가하고 5분 동안 5밀리몰 TCEP를 첨가하여 잔류물 IAA를 켄칭한다. 미세 원심분리기에서 샘플 튜브를 잠시 원심분리하고 튜브를 마그네틱 랙에 1분 동안 놓아 상층액을 제거합니다.
50밀리몰 트리스 버퍼에 200마이크로리터의 5밀리몰 TCEP를 추가하여 비드를 재현탁합니다. 1 마이크로그램의 트립신/Lys-C 혼합물을 1, 200 RPM 및 섭씨 37도에서 14시간 동안 추가합니다. 14시간 후, 0.2마이크로그램의 트립신/Lys-C 혼합물을 3시간 동안 추가하고, 샘플 튜브를 회전시킨 다음, 1분 동안 마그네틱 랙에 놓습니다.
그런 다음 펩타이드 상청액을 깨끗한 튜브로 옮깁니다. 다음으로, 50 분 동안 흔들면서 50 마이크로 리터의 50 밀리몰 트리스 버퍼로 비드를 세척하고, 펩타이드 상청액을 결합하고, 30 마이크로 리터의 10 % 트리 플루오로 아세트산을 튜브에 첨가하여 pH를 3 미만으로 낮 춥니 다. 펩타이드 탈염 후 건조.
LC-MS 분석을 위해 LC 완충액에 펩타이드 샘플을 재현탁시킨다. 상청액을 LC 샘플 바이알로 옮겨 나노 LC-MS로 분석합니다. LC-MS 분석법 파일에서 스트렙타비딘, 트립신 및 Lys-C와 같은 매우 풍부한 오염 물질 펩타이드 피크에 대한 특정 질량 및 머무름 시간 범위가 포함된 맞춤형 LC-MS 제외 목록을 추가합니다.
단백질체학 데이터 분석 소프트웨어로 LC-MC 원시 데이터를 분석합니다. 스위스-프로트 호모 사피엔스 참조 데이터베이스인 두 개의 FASTA 라이브러리와 UniProt ID에 오염 물질 접두사가 있는 새로 구축된 범용 오염 물질 FASTA 라이브러리를 포함합니다.단백질 및 펩타이드 스펙트럼 일치 식별을 위해 1%거짓 발견률로 데이터 분석 매개변수를 설정합니다. 3 개의 누락 된 절단, 시스틴 카르 바 미딜 메틸화의 고정 변형, 메티오닌 산화의 가변 변형 및 단백질 말단 아세틸 화가있는 트립신 소화를 선택하십시오.
무표지 정량화를 위해 펩타이드 MS-I 피크 강도를 내인성 비오티닐화 카르복실라제 PCCA로 정규화하고 근접 표지 실험의 변동을 줄입니다. 단백질체학 소프트웨어의 단백질 수준 결과를 Excel 파일로 내보냅니다. 통계 분석 전에 오염 단백질 및 PSM이 하나만 있거나 정량화 결과가없는 단백질을 제거하십시오.
iPSC 뉴런의 상이한 시점에서의 세포 형태는 3 일의 분화 기간 동안 신경 돌기 성장을 보여 주었다. 뉴런 배지에서 폴리 -L- 오르니 틴 코팅 플레이트로 전환 한 후, 뉴런은 뉴런 사이에 네트워크를 형성하고 축삭 확장은 2 주 만에 성숙 후 더 잘 보이게되었습니다. 형광 영상에서, 비오틴화 단백질의 LAMP1 정점 활성은 스트렙타비딘에 의해 염색되고 뉴런에서 LAMP1 염색과 공동 국소화되었다.
비드 적정 분석의 결과는 스트렙타비딘 비드 양을 증가시킬 때 포획되지 않은 비오티닐화 단백질 신호의 감소를 입증했습니다. 5마이크로리터의 스트렙타비딘 비드는 내인성 LAMP1 정점 샘플에서 50마이크로그램의 입력 단백질에 최적이었습니다. 트립신/Lys-C 혼합을 사용한 비드 상의 분해는 트립신 단독과 비교할 때 더 많은 단백질 및 펩타이드 식별과 누락된 절단을 줄였습니다.
또한, 1 내지 1.5 마이크로그램의 트립신/Lys-C는 가장 많은 수의 확인된 단백질과 가장 낮은 비율의 결손 절단을 얻기 위해 비드 위 분해에 최적인 것으로 밝혀졌다. 알려진 리소좀 막 단백질은 LAMP1 정점에서 증가하였고 정점 대조군은 없었다. 내인성 비오티닐화 단백질은 매우 풍부하지만 변하지 않습니다.
GO 용어 및 단백질 네트워크 분석은 안정적인 리소좀 막 단백질 및 엔도리소좀 트래피킹 및 수송과 관련된 일시적인 리소좀 인터랙터가 LAMP1 정점 단백질체학에서 풍부함을 시사했습니다. Apex 근접 라벨링은 산화 스트레스와 실험 변화를 줄이기 위해 정확히 1분 안에 담금질되어야 합니다. 우리는 최근에 비오틴화 단백질을 풍부하게 할 수 있는 절단 가능한 비오틴 방법을 개발했습니다.
이 방법을 현재의 방법과 결합하면 스트렙타비딘과 내인성 비오티닐화 단백질의 간섭을 줄일 수 있습니다. 우리는이 방법을 뇌 질환을 일으키는 유전 적 변이가있는 야생형 및 돌연변이 뉴런 모두에 적용 할 수 있습니다. 이것은 유전 적 돌연변이가 인간 뉴런의 리소좀 미세 환경에 어떻게 그리고 왜 영향을 미치는지 이해하는 데 도움이 될 수 있습니다.
