Os lisossomos são os sistemas de descarte de lixo da célula. As atividades lisossômicas são altamente dinâmicas e muito difíceis de capturar. Neste estudo, desenvolvemos uma abordagem proteômica de marcação de proximidade para decifrar o microambiente lisossômico em neurônios humanos vivos.
Esta abordagem captura as proteínas da membrana do lisossomo e as interações estáveis e transitórias com os neurônios derivados do lisossomo e da iPSC. A disfunção lisossômica está fortemente implicada em várias doenças cerebrais. Esta técnica pode ser aplicada para entender várias doenças cerebrais e fornecer potenciais alvos moleculares para projetar novas terapias.
Para iniciar o procedimento de marcação de proximidade, observe os neurônios sob um microscópio para garantir que eles estejam vivos e saudáveis. Pegue um meio volume de meio de meio da cultura para misturar com biotina fenol e adicione-o de volta aos neurônios a uma concentração final de 500 micromolares por 30 minutos em uma incubadora de 37 graus Celsius. Iniciar a reação de marcação adicionando solução de peróxido de hidrogênio recém-preparada na cultura de neurônios na concentração final de um milimolar.
Após uma incubação de um minuto, aspirar o meio e enxaguar a cultura três vezes com tampão de têmpera. Incline a placa para aspirar todo o tampão residual. Depois de adicionar tampão de lise gelado, raspe os lisados celulares em tubos frios de 1,5 mililitro.
Sonicate os tubos em um banho de água gelada a mais de 100 watts por 15 minutos com ciclos alternados de 40 segundos ligados e 20 segundos desligados. Após a lise celular, adicionar acetona fria a menos 20 graus Celsius à amostra a um volume de quatro vezes da solução de lisado celular. Vórtice brevemente e incubar a menos 20 graus Celsius por três horas para precipitar proteínas e remover resíduos de biotina fenol.
Centrifugar o tubo de lisado celular a 16, 500 vezes G durante 10 minutos a dois graus Celsius e remover cuidadosamente o sobrenadante sem perturbar o pellet de proteína. Em seguida, lave o pellet duas vezes com um mililitro de acetona a menos 20 graus Celsius, seguido de centrifugação e remoção do sobrenadante. Em seguida, seque o pellet de proteína com um concentrador a vácuo por um minuto.
Adicione tampão de lise celular para dissolver completamente o pellet com vórtice ou sonicação. Tome 20 microlitros de alíquota para determinar a concentração total de proteína pelo ensaio DCA. Armazenar a solução celular restante a menos 80 graus Celsius.
Pegue a amostra de lisado de proteína do congelador de menos 80 graus Celsius e sonicate o tubo de amostra por 30 segundos para descongelamento rápido. Vórtice, centrífuga brevemente com uma minicentrífuga de bancada e coloque o tubo de amostra no gelo. Em seguida, transfira 250 microlitros de pasta magnética de esferas de estreptavidina para cada tubo de 1,5 mililitro.
Coloque esses tubos em um rack magnético por um minuto, lave as contas três vezes com um mililitro de solução de dodecil sulfato de sódio a 2% e remova o tampão residual. Com base na concentração de proteína total dos lisados celulares e nos resultados do ensaio de titulação de contas, adicione a quantidade calculada de amostra de proteína necessária para 250 microlitros da pasta magnética de grânulos de estreptavidina. Em seguida, adicione o tampão de lise celular à mistura magnética de grânulos-lisado ao volume total de um microlitro e gire o tubo durante a noite a quatro graus Celsius.
No dia seguinte, centrifugar o tubo de amostra brevemente em uma microcentrífuga de bancada e colocar o tubo em um rack magnético por um minuto para remover o sobrenadante. Em seguida, lave as contas duas vezes usando um mililitro de tampão de lavagem A com cinco minutos de rotação à temperatura ambiente. Repita o processo com cada tampão de lavagem duas vezes, sequencialmente, com tampão B, tampão C e tampão D a quatro graus Celsius.
Coloque o tubo em um rack magnético por um minuto e remova o sobrenadante. Em seguida, ressuscite as esferas em 100 microlitros de TCEP de cinco milimolares em tampão Tris de 50 milimolares para incubar por 30 minutos em um timbificador a 37 graus Celsius, seguido de adição de IAA de 15 milimolares por 30 minutos no escuro e adição de TCEP de cinco milimolares por cinco minutos para extinguir o resíduo IAA. Centrifugar o tubo de amostra brevemente em uma microcentrífuga e colocar o tubo em um rack magnético por um minuto para remover o sobrenadante.
Adicione 200 microlitros de TCEP de cinco milimolares em tampão Tris de 50 milimolares para ressuspender as contas. Adicione um micrograma de mistura de tripsina/Lys-C durante 14 horas a 1, 200 RPM e 37 graus Celsius. Após 14 horas, adicione 0,2 microgramas adicionais de mistura de tripsina / Lys-C por três horas, gire os tubos de amostra e coloque-os em um rack magnético por um minuto.
Em seguida, transfira o sobrenadante peptídico para os tubos limpos. Em seguida, lave as contas com 50 microlitros de tampão Tris de 50 milimolares com agitação por cinco minutos, combine os sobrenadantes peptídicos e adicione 30 microlitros de ácido trifluoroacético a 10% ao tubo para reduzir o pH para menos de três. Após a dessalinização e secagem do péptido.
ressuspender as amostras peptídicas em tampão LC para análise de LC-MS. Transfira o sobrenadante para o frasco para injetáveis de amostra de LC para analisar com nano LC-MS. No arquivo de método LC-MS, adicione uma lista de exclusão LC-MS personalizada com massas específicas e intervalos de tempo de retenção para picos de peptídeos contaminantes altamente abundantes, como estreptavidina, tripsina e Lys-C.
Analise os dados brutos do LC-MC com o software de análise de dados proteômicos. Inclua duas bibliotecas FASTA, um banco de dados de referência Homo sapiens Swiss-Prot e uma biblioteca FASTA de contaminantes universais recém-construída com um prefixo de contaminante no UniProt ID.Configure os parâmetros de análise de dados com uma taxa de descoberta falsa de 1% para identificações de correspondência espectral de proteínas e peptídeos. Selecione a digestão de tripsina com três clivagens perdidas, uma modificação fixa da metilação da cistina carbamidil, uma modificação variável da oxidação da metionina e acetilação terminal final da proteína.
Para quantificação sem rótulo, normalizar as intensidades de pico do peptídeo MS-I para a carboxilase endogenamente biotinilada PCCA e reduzir as variações nos experimentos de marcação de proximidade. Exportar resultados de nível de proteína do software proteômico como um arquivo Excel. Antes da análise estatística, remova as proteínas contaminantes e as proteínas com apenas um PSM ou nenhum resultado de quantificação.
Morfologias celulares em diferentes pontos de tempo dos neurônios iPSC ilustraram o crescimento da neurita durante o período de diferenciação de três dias. Depois de mudar para placas revestidas de poli-L-ornitina no meio neurônio, os neurites formaram uma rede entre os neurônios e as extensões axonais tornaram-se mais visíveis após a maturação em duas semanas. Na imagem de fluorescência, a atividade ápice da LAMP1 das proteínas biotiniladas foi corada por estreptavidina e co-localizada com a coloração LAMP1 em neurônios.
Os resultados do ensaio de titulação de esferas demonstraram um declínio dos sinais de proteína biotinilada não capturados ao aumentar a quantidade de esferas de estreptavidina. Cinco microlitros de esferas de estreptavidina foram ótimos para 50 microgramas de proteínas de entrada de amostras endógenas do ápice LAMP1. A digestão em esferas com mistura de tripsina/Lys-C resultou em mais identificações de proteínas e peptídeos e menos clivagens perdidas quando comparadas com tripsina isolada.
Além disso, 1 a 1,5 microgramas de tripsina / Lys-C foram considerados ideais para a digestão em esferas para obter o maior número de proteínas identificadas e a menor porcentagem de clivagens perdidas. Proteínas conhecidas da membrana lisossômica foram aumentadas no ápice da LAMP1 versus nenhum controle do ápice. As proteínas endogenamente biotiniladas são altamente abundantes, mas permanecem inalteradas.
O termo GO e a análise da rede de proteínas sugeriram que as proteínas estáveis da membrana lisossômica e os interatores lisossômicos transitórios relacionados ao tráfico e transporte endolisossômico foram enriquecidos em proteômica do ápice LAMP1. A marcação de proximidade do Apex deve ser extinta em exatamente um minuto para reduzir o estresse oxidativo e as variações experimentais. Desenvolvemos recentemente um método de biotina clivável que nos permite enriquecer proteínas biotiniladas.
Este método, quando combinado com o nosso método atual, nos permitirá reduzir as interferências da estreptavidina e das proteínas endogenamente biotiniladas. Podemos aplicar esse método a neurônios selvagens e mutantes com variantes genéticas que causam doenças cerebrais. Isso pode nos ajudar a entender como e por que as mutações genéticas influenciam o microambiente lisossômico em neurônios humanos.
