Lysosomen sind die Müllentsorgungssysteme der Zelle. Die lysosomalen Aktivitäten sind hochdynamisch und sehr schwer zu erfassen. In dieser Studie haben wir einen Proximity-Labeling-Proteomik-Ansatz entwickelt, um die lysosomale Mikroumgebung in lebenden menschlichen Neuronen zu entschlüsseln.
Dieser Ansatz erfasst die Lysosomenmembranproteine und die stabilen und vorübergehenden Wechselwirkungen mit den Lysosomen- und iPSC-abgeleiteten Neuronen. Lysosomale Dysfunktion ist stark an verschiedenen Hirnerkrankungen beteiligt. Diese Technik kann angewendet werden, um verschiedene Gehirnerkrankungen zu verstehen und potenzielle molekulare Ziele für die Entwicklung neuer Therapien bereitzustellen.
Um das Verfahren zur Proximity-Markierung zu beginnen, beobachten Sie die Neuronen unter einem Mikroskop, um sicherzustellen, dass sie lebendig und gesund sind. Nehmen Sie ein halbes Volumen Medium aus der Kultur, mischen Sie es mit Biotinphenol und fügen Sie es den Neuronen in einer Endkonzentration von 500 Mikromolar für 30 Minuten in einem 37 Grad Celsius Inkubator hinzu. Die Markierungsreaktion wird eingeleitet, indem frisch hergestellte Wasserstoffperoxidlösung in die Neuronenkultur mit einer Millimolar-Endkonzentration gegeben wird.
Nach einer einminütigen Inkubation saugen Sie das Medium ab und spülen Sie die Kultur dreimal mit Abschreckpuffer ab. Neigen Sie die Platte, um den gesamten Restpuffer abzusaugen. Nach Zugabe von eiskaltem Lysepuffer kratzen Sie die Zelllysate in kalte 1,5-Milliliter-Röhrchen.
Beschallen Sie die Röhrchen in einem eiskalten Wasserbad mit mehr als 100 Watt für 15 Minuten mit abwechselnden Zyklen von 40 Sekunden an und 20 Sekunden aus. Nach der Zelllyse wird kaltes Aceton bei minus 20 Grad Celsius zu einem vierfachen Volumen der Zelllysatlösung in die Probe gegeben. Wirbeln Sie kurz und inkubieren Sie bei minus 20 Grad Celsius für drei Stunden, um Proteine auszufällen und Rückstände von Biotinphenol zu entfernen.
Zentrifugieren Sie das Zelllysatröhrchen bei 16,500 mal G für 10 Minuten bei zwei Grad Celsius und entfernen Sie vorsichtig den Überstand, ohne das Proteinpellet zu stören. Dann waschen Sie das Pellet zweimal mit einem Milliliter Aceton bei minus 20 Grad Celsius, gefolgt von Zentrifugation und Entfernung des Überstands. Als nächstes trocknen Sie das Proteinpellet mit einem Vakuumkonzentrator für eine Minute.
Fügen Sie Zelllysepuffer hinzu, um das Pellet vollständig mit Wirbel oder Beschallung aufzulösen. Nehmen Sie 20 Mikroliter Aliquot, um die Gesamtproteinkonzentration durch den DCA-Assay zu bestimmen. Lagern Sie die restliche Zelllösung bei minus 80 Grad Celsius.
Nehmen Sie die Proteinlysatprobe aus dem Gefrierschrank von minus 80 Grad Celsius und beschallen Sie das Probenröhrchen für 30 Sekunden zum schnellen Auftauen. Vortex, kurz mit einer Minizentrifuge auf den Tischtisch zentrifugieren und das Probenröhrchen auf Eis legen. Als nächstes werden 250 Mikroliter Streptavidin-Magnetperlenpaste in jedes 1,5-Milliliter-Röhrchen überführt.
Legen Sie diese Röhrchen für eine Minute auf ein Magnetgestell, waschen Sie die Perlen dreimal mit einem Milliliter 2% Natriumdodecylsulfatlösung und entfernen Sie den Restpuffer. Basierend auf der Gesamtproteinkonzentration der Zelllysate und den Ergebnissen des Adstitrationstests wird die berechnete Menge an Proteinprobe hinzugefügt, die für 250 Mikroliter der magnetischen Streptavidin-Bead-Aufschlämmung benötigt wird. Dann fügen Sie dem magnetischen Bead-Lysat-Gemisch einen Zelllysepuffer auf das Gesamtvolumen von einem Mikroliter hinzu und drehen das Röhrchen über Nacht bei vier Grad Celsius.
Am nächsten Tag zentrifugieren Sie das Probenröhrchen kurz auf einer Tischmikrozentrifuge und legen Sie das Röhrchen für eine Minute auf ein Magnetgestell, um den Überstand zu entfernen. Dann waschen Sie die Perlen zweimal mit einem Milliliter Waschpuffer A mit fünf Minuten Umdrehung bei Raumtemperatur. Wiederholen Sie den Vorgang mit jedem Waschpuffer zweimal, nacheinander, mit Puffer B, Puffer C und Puffer D bei vier Grad Celsius.
Legen Sie das Rohr für eine Minute auf ein Magnetgestell und entfernen Sie den Überstand. Anschließend werden die Beads in 100 Mikrolitern Fünf-Millimolar-TCEP in 50-Millimolar-Tris-Puffer resuspendiert, um 30 Minuten auf einem Thermomixer bei 37 Grad Celsius zu inkubieren, gefolgt von einer 15-Millimolar-IAA-Zugabe für 30 Minuten im Dunkeln und einer Fünf-Millimolar-TCEP-Zugabe für fünf Minuten, um die Rückstände von IAA zu löschen. Zentrifugieren Sie das Probenröhrchen kurz auf einer Mikrozentrifuge und legen Sie das Röhrchen eine Minute lang auf ein Magnetgestell, um den Überstand zu entfernen.
Fügen Sie 200 Mikroliter Fünf-Millimolar-TCEP in 50-Millimolar-Tris-Puffer hinzu, um die Perlen zu resuspendieren. Fügen Sie ein Mikrogramm Trypsin / Lys-C-Mischung für 14 Stunden bei 1.200 U/min und 37 Grad Celsius hinzu. Nach 14 Stunden fügen Sie weitere 0,2 Mikrogramm Trypsin / Lys-C-Mischung für drei Stunden hinzu, drehen Sie die Probenröhrchen herunter und legen Sie sie für eine Minute auf ein Magnetgestell.
Dann übertragen Sie den Peptidüberstand in die sauberen Röhrchen. Als nächstes waschen Sie die Perlen mit 50 Mikrolitern 50-Millimolar-Tris-Puffer mit Schütteln für fünf Minuten, kombinieren Sie die Peptidüberstände und fügen Sie 30 Mikroliter 10% Trifluoressigsäure in die Röhre hinzu, um den pH-Wert auf weniger als drei zu senken. Nach Peptidentsalzung und Trocknung.
Resuspendieren Sie die Peptidproben im LC-Puffer für die LC-MS-Analyse. Übertragen Sie den Überstand zur Analyse mit nano LC-MS in das LC-Probenfläschchen. Fügen Sie in der LC-MS-Methodendatei eine benutzerdefinierte LC-MS-Ausschlussliste mit spezifischen Massen und Retentionszeitbereichen für sehr häufige kontaminierende Peptidpeaks wie Streptavidin, Trypsin und Lys-C hinzu.
Analysieren Sie die LC-MC-Rohdaten mit der Proteomik-Datenanalysesoftware. Fügen Sie zwei FASTA-Bibliotheken, eine Swiss-Prot Homo sapiens-Referenzdatenbank und eine neu erstellte universelle Schadstoff-FASTA-Bibliothek mit einem Kontaminantenpräfix in der UniProt-ID hinzu.Richten Sie die Datenanalyseparameter mit einer 1%Falschentdeckungsrate für Protein- und Peptid-Spektral-Matching-Identifikationen ein. Wählen Sie den Trypsinaufschluss mit drei verpassten Spaltungen, einer festen Modifikation der Cystincarbamidylmethylierung, einer variablen Modifikation der Methioninoxidation und der terminalen Acetylierung von Proteinen.
Für eine markierungsfreie Quantifizierung normalisieren Sie die Peptid-MS-I-Spitzenintensitäten zur endogen biotinylierten Carboxylase PCCA und reduzieren Sie die Variationen in Proximity-Markierungsexperimenten. Exportieren Sie Proteinlevel-Ergebnisse aus der Proteomik-Software als Excel-Datei. Entfernen Sie vor der statistischen Analyse kontaminierende Proteine und Proteine mit nur einem PSM oder ohne Quantifizierungsergebnis.
Zellmorphologien zu verschiedenen Zeitpunkten der iPSC-Neuronen veranschaulichten das Neuritenwachstum während der dreitägigen Differenzierungsperiode. Nach dem Wechsel zu Poly-L-Ornithin-beschichteten Platten im Neuronenmedium bildeten die Neuriten ein Netzwerk zwischen Neuronen und axonale Fortsätze wurden nach der Reifung in zwei Wochen sichtbarer. In der Fluoreszenzbildgebung wurde die LAMP1-Apexaktivität von biotinylierten Proteinen durch Streptavidin gefärbt und mit der LAMP1-Färbung in Neuronen kolokalisiert.
Die Ergebnisse des Bead-Titrations-Assays zeigten einen Rückgang der nicht erfassten biotinylierten Proteinsignale bei Erhöhung der Menge an Streptavidin-Kügelchen. Fünf Mikroliter Streptavidin-Perlen waren optimal für 50 Mikrogramm Eingangsproteine aus endogenen LAMP1-Apex-Proben. Die Auf-Perlen-Verdauung mit Trypsin / Lys-C-Mischung führte zu mehr Protein- und Peptididentifikationen und weniger verpassten Spaltungen im Vergleich zu Trypsin allein.
Darüber hinaus erwiesen sich 1 bis 1,5 Mikrogramm Trypsin / Lys-C als optimal für die Auf-Perlen-Verdauung, um die höchste Anzahl identifizierter Proteine und den niedrigsten Prozentsatz an verpassten Spaltungen zu erhalten. Bekannte lysosomale Membranproteine waren in der LAMP1-Apex im Vergleich zu keiner Apex-Kontrolle erhöht. Endogene biotinylierte Proteine sind sehr häufig, bleiben aber unverändert.
Die GO-Term- und Proteinnetzwerkanalyse deutete darauf hin, dass stabile lysosomale Membranproteine und transiente lysosomale Interaktoren im Zusammenhang mit endolysosomem Transport und Transport in der LAMP1-Apex-Proteomik angereichert waren. Die Apex-Proximity-Markierung muss in genau einer Minute gelöscht werden, um oxidativen Stress und experimentelle Schwankungen zu reduzieren. Wir haben kürzlich eine spaltbare Biotinmethode entwickelt, mit der wir biotinylierte Proteine anreichern können.
Diese Methode, wenn sie mit unserer aktuellen Methode kombiniert wird, wird es uns ermöglichen, die Interferenzen von Streptavidin und endogen biotinylierten Proteinen zu reduzieren. Wir können diese Methode sowohl auf Wildtyp- als auch auf mutierte Neuronen mit genetischen Varianten anwenden, die Gehirnerkrankungen verursachen. Dies kann uns helfen zu verstehen, wie und warum genetische Mutationen die lysosomale Mikroumgebung in menschlichen Neuronen beeinflussen.
