リソソームは細胞のゴミ処理システムです。リソソームの活動は非常に動的であり、捕捉することは非常に困難です。本研究では、生きたヒトニューロンのリソソーム微小環境を解読するための近接標識プロテオミクスアプローチを開発しました。
このアプローチは、リソソーム膜タンパク質と、リソソームおよびiPS細胞由来のニューロンとの安定で一過性の相互作用を捕捉します。リソソーム機能障害は、さまざまな脳疾患に大きく関係しています。この手法は、さまざまな脳疾患を理解し、新しい治療法を設計するための潜在的な分子標的を提供するために適用できます。
近接標識の手順を開始するには、顕微鏡でニューロンを観察して、ニューロンが生きていて健康であることを確認します。培養液から半分の量の培地を取り出し、ビオチンフェノールと混合し、摂氏37度のインキュベーターで30分間、最終濃度500マイクロモルでニューロンに戻します。新たに調製した過酸化水素溶液を最終濃度1ミリモルでニューロン培養液に加えることにより、標識反応を開始します。
1分間のインキュベーション後、培地を吸引し、クエンチバッファーで培養物を3回すすぎます。プレートを傾けて、すべての残留バッファーを吸引します。氷冷溶解バッファーを加えた後、細胞ライセートを冷たい1.5ミリリットルのチューブにこすり落とします。
100ワット以上の氷冷水浴中でチューブを15分間超音波処理し、40秒オンと20秒オフの交互サイクルを行います。細胞溶解後、摂氏マイナス20度の冷たいアセトンを4倍容量の細胞ライセート溶液でサンプルに加えます。ボルテックスを短時間行い、マイナス20°Cで3時間インキュベートしてタンパク質を沈殿させ、残留ビオチンフェノールを除去します。
細胞ライセートチューブを摂氏2度で10分間16、500倍Gで遠心分離し、タンパク質ペレットを乱すことなく上清を注意深く除去します。その後、ペレットをマイナス20°Cで1ミリリットルのアセトンで2回洗浄し、遠心分離して上清を除去した。次に、タンパク質ペレットを真空濃縮器で1分間乾燥させます。
細胞溶解バッファーを加えて、ペレットを渦または超音波処理で完全に溶解します。20マイクロリットルのアリコートを取り、DCAアッセイによって総タンパク質濃度を測定します。残りの細胞溶液は摂氏マイナス80度で保管します。
マイナス80°Cの冷凍庫からタンパク質ライセートサンプルを取り出し、サンプルチューブを30秒間超音波処理してすばやく解凍します。ボルテックス、ベンチトップミニ遠心分離機で短時間遠心分離し、試料管を氷上に置く。次に、250マイクロリットルのストレプトアビジン磁気ビーズスラリーを各1.5ミリリットルのチューブに移します。
これらのチューブを磁気ラックに1分間置き、1ミリリットルの2%ドデシル硫酸ナトリウム溶液でビーズを3回洗浄し、残留バッファーを取り除きます。細胞ライセートの総タンパク質濃度とビーズ滴定アッセイの結果に基づいて、250マイクロリットルのストレプトアビジン磁気ビーズスラリーに必要な計算量のタンパク質サンプルを追加します。次に、細胞溶解バッファーを磁気ビーズ-ライセート混合物に全容量1マイクロリットルまで加え、チューブを摂氏4度で一晩回転させます。
翌日、ベンチトップマイクロ遠心分離機でサンプルチューブを短時間遠心分離し、チューブを磁気ラックに1分間置いて上清を除去します。その後、1ミリリットルの洗浄バッファーAを用いてビーズを室温で5分間回転させて2回洗浄した。各洗浄バッファーでこのプロセスを、バッファーB、バッファーC、およびバッファーDで摂氏4度で2回、順番に繰り返します。
チューブを磁気ラックに1分間置き、上清を取り除きます。次に、ビーズを50ミリモルのトリス緩衝液中の100マイクロリットルの5ミリモルTCEPに再懸濁し、摂氏37度のサーモミキサーで30分間インキュベートした後、暗所で15ミリモルのIAAを30分間添加し、5ミリモルのTCEPを5分間添加して残留IAAをクエンチします。サンプルチューブをマイクロ遠心分離機で短時間遠心分離し、チューブを磁気ラックに1分間置き、上清を除去します。
50ミリモルのトリスバッファーに200マイクロリットルの5ミリモルTCEPを加えて、ビーズを再懸濁します。1マイクログラムのトリプシン/ Lys-Cミックスを1, 200 RPMおよび摂氏37度で14時間加えます。14時間後、さらに0.2マイクログラムのトリプシン/Lys-Cミックスを3時間加え、サンプルチューブを回転させて、磁気ラックに1分間置きます。
次いで、ペプチド上清を清浄なチューブに移す。次に、ビーズを50マイクロリットルの50ミリモルトリス緩衝液で5分間振とうしながら洗浄し、ペプチド上清を混ぜ合わせ、30マイクロリットルの10%トリフルオロ酢酸をチューブに加えてpHを3未満に下げます。ペプチド脱塩後、乾燥する。
ペプチドサンプルをLC-MS分析のためにLCバッファーに再懸濁します。上清をLCサンプルバイアルに移し、ナノLC-MSで分析します。LC-MS メソッドファイルで、ストレプトアビジン、トリプシン、Lys-C などの非常に豊富な夾雑ペプチドピークの特定の質量と保持時間範囲を含むカスタム LC-MS 除外リストを追加します。
プロテオミクスデータ解析ソフトウェアでLC-MC生データを解析します。2つのFASTAライブラリ、スイスプロットホモサピエンス参照データベース、およびUniProt IDに汚染物質プレフィックスを持つ新しく構築されたユニバーサル汚染物質FASTAライブラリを含めますタンパク質およびペプチドスペクトルマッチング同定のための1%の偽発見率でデータ分析パラメーターを設定します。3つの切断漏れ、シスチンカルバミジルメチル化の固定修飾、メチオニン酸化の可変修飾、およびタンパク質末端アセチル化を伴うトリプシン消化を選択します。
ラベルフリー定量では、ペプチドMS-Iピーク強度を内因性ビオチン化カルボキシラーゼPCCAに正規化し、近接標識実験の変動を減らします。プロテオミクスソフトウェアからタンパク質レベルの結果をExcelファイルとしてエクスポートします。統計解析の前に、汚染物質タンパク質およびPSMが1つしかない、または定量結果が得られないタンパク質を除去します。
iPS細胞ニューロンの異なる時点における細胞形態は、3日間の分化期間中の神経突起伸長を示した。ニューロン培地でポリ-L-オルニチンコートプレートに切り替えた後、神経突起はニューロン間にネットワークを形成し、2週間で成熟した後に軸索伸長がより目に見えるようになりました。蛍光イメージングでは、ビオチン化タンパク質のLAMP1頂点活性をストレプトアビジンで染色し、ニューロンのLAMP1染色と共局在させました。
ビーズ滴定アッセイの結果は、ストレプトアビジンビーズ量を増加させると、捕捉されていないビオチン化タンパク質シグナルの減少を示した。5マイクロリットルのストレプトアビジンビーズは、内因性LAMP1頂点サンプルからの50マイクログラムのインプットタンパク質に最適でした。トリプシン/Lys-Cミックスによるビーズ上での消化により、トリプシン単独と比較して、タンパク質とペプチドの同定が多くなり、切断漏れが少なくなりました。
さらに、1〜1.5マイクログラムのトリプシン/ Lys-Cがビーズ上での消化に最適であり、同定されたタンパク質の数が最も多く、切断の見逃しの割合が最も低いことがわかりました。既知のリソソーム膜タンパク質は、LAMP1頂点で増加し、頂点コントロールなしと比較して増加しました。内因性ビオチン化タンパク質は非常に豊富ですが、変化しません。
GO用語とタンパク質ネットワーク解析は、LAMP1頂点プロテオミクスにおいて、エンドリソソーム輸送および輸送に関連する安定なリソソーム膜タンパク質および一過性リソソーム相互作用因子が濃縮されていることを示唆した。頂点近接標識は、酸化ストレスと実験の変動を減らすために、正確に1分で急冷する必要があります。私たちは最近、ビオチン化タンパク質を濃縮することを可能にする切断可能なビオチン法を開発しました。
この方法は、現在の方法と組み合わせることで、ストレプトアビジンや内因性ビオチン化タンパク質からの干渉を減らすことができます。この方法は、脳疾患を引き起こす遺伝的変異を持つ野生型ニューロンと変異型ニューロンの両方に適用できます。これは、遺伝子変異がヒトニューロンのリソソーム微小環境にどのように影響するか、そしてなぜ影響を与えるのかを理解するのに役立ちます。
