Los lisosomas son los sistemas de eliminación de basura de la célula. Las actividades lisosomales son altamente dinámicas y muy difíciles de capturar. En este estudio, desarrollamos un enfoque proteómico de etiquetado de proximidad para descifrar el microambiente lisosomal en neuronas humanas vivas.
Este enfoque captura las proteínas de membrana del lisosoma y las interacciones estables y transitorias con el lisosoma y las neuronas derivadas de iPSC. La disfunción lisosomal está fuertemente implicada en diversas enfermedades cerebrales. Esta técnica se puede aplicar para comprender diversas enfermedades cerebrales y proporcionar posibles dianas moleculares para diseñar nuevas terapias.
Para comenzar el procedimiento de etiquetado de proximidad, observe las neuronas bajo un microscopio para asegurarse de que estén vivas y saludables. Tome medio volumen de medio del cultivo para mezclarlo con biotina fenol y agréguelo nuevamente a las neuronas a una concentración final de 500 micromolares durante 30 minutos en una incubadora de 37 grados centígrados. Inicie la reacción de etiquetado agregando una solución de peróxido de hidrógeno recién preparada en el cultivo neuronal a una concentración final milimolar.
Después de una incubación de un minuto, aspirar el medio y enjuagar el cultivo tres veces con tampón de enfriamiento. Incline la placa para aspirar todo el tampón residual. Después de agregar tampón de lisis helada, raspe los lisados celulares en tubos fríos de 1.5 mililitros.
Sonicar los tubos en un baño de agua helada a más de 100 vatios durante 15 minutos con ciclos alternos de 40 segundos encendidos y 20 segundos apagados. Después de la lisis celular, agregue acetona fría a menos 20 grados centígrados a la muestra a un volumen cuatro veces mayor de la solución de lisado celular. Vortex brevemente e incubar a menos 20 grados centígrados durante tres horas para precipitar proteínas y eliminar el residuo de biotina fenol.
Centrifugar el tubo de lisado celular a 16, 500 veces G durante 10 minutos a dos grados centígrados y retire con cuidado el sobrenadante sin alterar el pellet de proteína. Luego, lave el pellet dos veces con un mililitro de acetona a menos 20 grados centígrados, seguido de centrifugación y eliminación del sobrenadante. A continuación, seque el pellet de proteína con un concentrador de vacío durante un minuto.
Agregue un tampón de lisis celular para disolver completamente el gránulo con vórtice o sonicación. Tome 20 microlitros de alícuota para determinar la concentración total de proteína mediante el ensayo DCA. Guarde la solución celular restante a menos 80 grados centígrados.
Tome la muestra de lisado de proteínas del congelador de menos 80 grados centígrados y sonicar el tubo de muestra durante 30 segundos para una descongelación rápida. Vortex, centrifugar brevemente con una mini centrífuga de sobremesa y colocar el tubo de muestra sobre hielo. A continuación, transfiera 250 microlitros de suspensión magnética de estreptavidina a cada tubo de 1.5 mililitros.
Coloque estos tubos en una rejilla magnética durante un minuto, lave las perlas tres veces con un mililitro de solución de dodecil sulfato de sodio al 2% y retire el tampón residual. Según la concentración total de proteína de los lisados celulares y los resultados del ensayo de titulación de perlas, agregue la cantidad calculada de muestra de proteína necesaria para 250 microlitros de la suspensión de perlas magnéticas de estreptavidina. Luego, agregue tampón de lisis celular a la mezcla magnética de lisado de perlas al volumen total de un microlitro y gire el tubo durante la noche a cuatro grados centígrados.
Al día siguiente, centrifugar brevemente el tubo de muestra en una microcentrífuga de sobremesa y colocar el tubo en una rejilla magnética durante un minuto para extraer el sobrenadante. Luego, lave las perlas dos veces usando un mililitro de tampón de lavado A con cinco minutos de rotación a temperatura ambiente. Repita el proceso con cada tampón de lavado dos veces, secuencialmente, con el tampón B, el tampón C y el tampón D a cuatro grados centígrados.
Coloque el tubo en una rejilla magnética durante un minuto y retire el sobrenadante. Luego, resuspenda las perlas en 100 microlitros de TCEP de cinco milimolares en tampón Tris de 50 milimolares para incubar durante 30 minutos en un termomezclador a 37 grados centígrados, seguido de la adición de IAA de 15 milimolares durante 30 minutos en la oscuridad y la adición de TCEP de cinco milimolares durante cinco minutos para apagar el residuo de IAA. Centrifugar el tubo de muestra brevemente en una microcentrífuga y colocar el tubo en una rejilla magnética durante un minuto para eliminar el sobrenadante.
Agregue 200 microlitros de TCEP de cinco milimolares en un tampón Tris de 50 milimolares para resuspender las perlas. Agregue un microgramo de mezcla de tripsina/Lys-C durante 14 horas a 1, 200 RPM y 37 grados centígrados. Después de 14 horas, agregue 0.2 microgramos adicionales de la mezcla de tripsina / Lys-C durante tres horas, gire los tubos de muestra y colóquelos en una rejilla magnética durante un minuto.
Luego, transfiera el sobrenadante peptídico a los tubos limpios. A continuación, lave las perlas con 50 microlitros de tampón Tris de 50 milimolares con agitación durante cinco minutos, combine los sobrenadantes peptídicos y agregue 30 microlitros de ácido trifluoroacético al 10% al tubo para reducir el pH a menos de tres. Después de la desalinización y secado del péptido.
resuspender las muestras de péptidos en tampón LC para el análisis de LC-MS. Transfiera el sobrenadante al vial de muestra de LC para analizarlo con nano LC-MS. En el archivo de método LC-MS, agregue una lista de exclusión de LC-MS personalizada con masas específicas y rangos de tiempo de retención para picos de péptidos contaminantes muy abundantes, como estreptavidina, tripsina y Lys-C.
Analice los datos sin procesar LC-MC con el software de análisis de datos proteómicos. Incluya dos bibliotecas FASTA, una base de datos de referencia Swiss-Prot Homo sapiens y una biblioteca FASTA de contaminantes universales de nueva construcción con un prefijo de contaminante en el ID de UniProt.Configure los parámetros de análisis de datos con una tasa de descubrimiento falso del 1% para identificaciones de coincidencia espectral de proteínas y péptidos. Seleccione la digestión de tripsina con tres divisiones perdidas, una modificación fija de la metilación de cistina carbamidil, una modificación variable de la oxidación de metionina y la acetilación terminal final de la proteína.
Para una cuantificación sin etiquetado, normalice las intensidades máximas del péptido MS-I a la carboxilasa endógenamente biotinilada PCCA y reduzca las variaciones en los experimentos de etiquetado de proximidad. Exporte los resultados del nivel de proteína desde el software de proteómica como un archivo de Excel. Antes del análisis estadístico, elimine las proteínas contaminantes y las proteínas con un solo PSM o ningún resultado de cuantificación.
Las morfologías celulares en diferentes puntos de tiempo de las neuronas iPSC ilustraron el crecimiento de neuritas durante el período de diferenciación de tres días. Después de cambiar a placas recubiertas de poli-L-ornitina en el medio neuronal, las neuritas formaron una red entre las neuronas y las extensiones axonales se hicieron más visibles después de la maduración en dos semanas. En las imágenes de fluorescencia, la actividad del ápice LAMP1 de las proteínas biotiniladas se tiñó con estreptavidina y se colocalizó con la tinción de LAMP1 en las neuronas.
Los resultados del ensayo de titulación de perlas demostraron una disminución de las señales de proteína biotinilada no capturadas al aumentar la cantidad de perlas de estreptavidina. Cinco microlitros de perlas de estreptavidina fueron óptimos para 50 microgramos de proteínas de entrada de muestras endógenas de ápice LAMP1. La digestión en perlas con la mezcla tripsina/Lys-C dio lugar a más identificaciones de proteínas y péptidos y menos divisiones perdidas en comparación con la tripsina sola.
Además, se encontró que de 1 a 1.5 microgramos de tripsina / Lys-C eran óptimos para la digestión en perlas para obtener el mayor número de proteínas identificadas y el porcentaje más bajo de escisiones perdidas. Las proteínas conocidas de la membrana lisosomal aumentaron en el ápice de LAMP1 versus ningún control del ápice. Las proteínas endógenamente biotiniladas son muy abundantes, pero permanecen sin cambios.
El análisis del término GO y la red de proteínas sugirió que las proteínas estables de la membrana lisosomal y los interactores lisosomales transitorios relacionados con el tráfico y transporte endolisosomal se enriquecieron en la proteómica del ápice LAMP1. El etiquetado de proximidad del ápice debe apagarse exactamente un minuto para reducir el estrés oxidativo y las variaciones experimentales. Recientemente hemos desarrollado un método de biotina escindible que nos permite enriquecer proteínas biotiniladas.
Este método, cuando se combina con nuestro método actual, nos permitirá reducir las interferencias de la estreptavidina y las proteínas endógenamente biotiniladas. Podemos aplicar este método tanto a neuronas de tipo salvaje como mutantes con variantes genéticas que causan enfermedades cerebrales. Esto puede ayudarnos a entender cómo y por qué las mutaciones genéticas influyen en el microambiente lisosomal en las neuronas humanas.
