ستساعد هذه الطريقة في تحديد وتأكيد ما إذا كان البروتين الموجود في الخلايا المصابة بفيروس الأنفلونزا يخضع للتحلل أو الانقسام بواسطة الكاسباز وتحديد مواقع انقسام الكاسباز. تتطلب هذه الطريقة فقط إعدادات مختبر البيولوجيا الجزيئية والخلوية الأساسية ومهارات البحث ولا تتطلب أي معدات متخصصة أو تدريب برمجي. يمكن تكييف هذه الطريقة لتحقيق أهداف مماثلة تنطوي على العدوى بفيروسات أو ميكروبات حيوانية أخرى ، والتعرض للمحفزات الخارجية ، مثل السموم والمواد الكيميائية.
للبدء ، قم بزرع خلايا MDCK أو A549 في لوحة زراعة خلايا مكونة من 12 بئرا. احتضان الخلايا طوال الليل عند 37 درجة مئوية تحت جو 5٪ من ثاني أكسيد الكربون. في اليوم التالي ، قم بإزالة وسط الاستزراع القديم من الخلايا واغسل الخلايا في كل بئر مرتين باستخدام ملليلتر واحد من MEM الخالي من المصل.
ثم تصيب الخلايا بإضافة 400 ميكرولتر من لقاح فيروس الأنفلونزا A ، وتضع اللوحة للحضانة لمدة ساعة واحدة. بعد الحضانة ، قم بإزالة لقاح الفيروس وغسل الخلايا باستخدام MEM. أضف ملليلتر واحد من MEM الخالي من المصل إلى كل بئر واحتضان الخلايا كما هو موضح في الخطوة السابقة.
بعد 24 ساعة ، احصد الخلايا عن طريق كشطها باستخدام مكبس حقنة سعة ملليلتر واحد ونقلها إلى أنبوب سعة 1.5 ملليلتر. الطرد المركزي الأنبوب في 12 ، 000G لمدة دقيقتين في درجة حرارة الغرفة وجمع طاف . اغسل حبيبات الخلية ب 250 ميكرولتر من محلول ملحي وجهاز طرد مركزي مخزن بالفوسفات.
قم بإزالة المادة الطافية وأضف 100 ميكرولتر من محلول تحلل الخلية. مزيج من دوامة. سخني الأنبوب عند 98 درجة مئوية لمدة 10 دقائق لتحلل الخلايا تماما.
بعد ذلك ، قم بحل كميات متساوية من البروتين من العينات غير المصابة والمصابة عن طريق الرحلان الكهربائي القياسي لهلام بولي أكريلاميد SDS. بعد الكهربائي ، انقل هلام البروتين إلى غشاء النيتروسليلوز أو PVDF وقم بإجراء النشاف الغربي. قارن مستويات البروتين في ممرات العينات المصابة المعالجة والمعالجة بالمثبطات.
في 100 ميكرولتر من الوسط المناسب ، مثل Opti-MEM ، قم بتخفيف 100 نانومولار من التحكم أو caspase siRNA ، أو الحجم المناسب من كاشف النقل. احتضان لمدة خمس دقائق في درجة حرارة الغرفة. امزج 100 ميكرولتر من كل محلول siRNA مع 100 ميكرولتر من محلول كاشف النقل واحتضانه لمدة 20 إلى 45 دقيقة في درجة حرارة الغرفة.
قم بتقسيم وإضافة 100،000 خلية MDCK أو A549 في 800 ميكرولتر من وسط النمو الكامل. أضف 200 ميكرولتر من مركب كاشف نقل siRNA وأضف هذا التعليق إلى لوحة استزراع مكونة من 12 بئرا. احتضان الخلايا عند 37 درجة مئوية تحت جو 5٪ من ثاني أكسيد الكربون لمدة 72 ساعة.
تصيب الخلايا بفيروس الأنفلونزا A ، ولكن بدون مثبطات. قم بإجراء النشاف الغربي ، وقارن مستويات البروتين كما هو موضح سابقا. حدد موقع زخارف الانقسام caspase XXXD و DXXD على عديد الببتيد.
تحور حمض الأسبارتيك P1 ، أو اثنين من حمض الجلوتاميك ، أو ألانين عن طريق الطفرات الموجهة للموقع والتأكيد عن طريق تسلسل الحمض النووي. في 100 ميكرولتر من وسط مناسب ، قم بتخفيف ميكروجرامين من الحمض النووي للبلازما من النوع البري أو الطافر أو الحجم الموصى به من كاشف النقل واحتضان الأنابيب لمدة خمس دقائق في درجة حرارة الغرفة. امزج 100 ميكرولتر من محلول الحمض النووي للبلازما مع 100 ميكرولتر من محلول كاشف النقل واحتضانه لمدة 20 إلى 45 دقيقة في درجة حرارة الغرفة.
في غضون ذلك ، قم بتقسيم وإضافة 300،000 خلية MDCK أو A549 إلى 800 ميكرولتر من وسط النمو الكامل. أضف 200 ميكرولتر من مركب كاشف نقل الحمض النووي وأضف هذا التعليق إلى لوحة استزراع مكونة من 12 بئرا. احتضان اللوحة عند 37 درجة مئوية تحت جو 5٪ من ثاني أكسيد الكربون.
بعد 48 ساعة ، تصيب الخلايا بفيروس الأنفلونزا A بدون مثبطات. قم بإجراء النشاف الغربي ، وقارن مستويات البروتين كما هو موضح سابقا. باستخدام النشاف الغربي ، تم تقييم تدهور الكورتاكتين المضيف بواسطة كاسباز المضيف الناجم عن الأنفلونزا.
أدى علاج الخلايا المصابة بفيروس الأنفلونزا بمثبط caspase-3 إلى إنقاذ الكورتاكتين وتدهور NP الفيروسي. أظهر القياس الكمي لشدة نطاقات الكورتاكتين وتطبيعها مع نطاق الأكتين المقابل أن مستوى الكورتاكتين في الخلايا المصابة المعالجة بمثبطات caspase-3 كان أعلى مقارنة بالخلايا المصابة غير المعالجة. في الخلايا المستنفدة caspase-6 أو caspase-7.
لم يلاحظ أي انتعاش كبير في مستويات عديد الببتيد الكورتاكتين ، بينما في الخلايا المستنفدة caspase-3 ، تعافى الكورتاكتين من التدهور الناجم عن فيروس الأنفلونزا. أظهر القياس الكمي ومقارنة مستويات عديد الببتيد أن مستوى عديد الببتيد الكورتاكتين في الخلايا المصابة بتعبير caspase-3 المستنفد كان أعلى من الخلايا ذات تعبير caspase-3 الطبيعي. أدت طفرة حمض الأسبارتيك في الموضع 116 إلى حمض الجلوتاميك إلى جعل عديد الببتيد الكورتاكتين مقاوما للتحلل الناجم عن فيروس الأنفلونزا.
أظهر القياس الكمي ومقارنة مستويات عديد الببتيد أن مستوى عديد الببتيد القشري الطافر في الخلايا المصابة كان أعلى من مستوى عديد الببتيد الكورتاكتين من النوع البري. مطلوب لتوليد عشرات الطفرات وإجراء النشاف الغربي المتكرر لتحديد موقع انقسام الكاسباز في عديد الببتيد. يمكن تطوير مقايسة كيميائية حيوية في المختبر تحتوي على كاسباز منقى وعديد ببتيد مستهدف للتأكد من أن البروتين محل الاهتمام هو ركيزة مباشرة قائمة على الغاز.
سيساعد هذا البروتوكول على فهم أهمية أو تدهور أو انشقاق البروتين المستهدف في النظام الذي تتم دراسته ، مثل الإصابة بالفيروس أو المرض.
