이 방법은 인플루엔자 바이러스 감염 세포의 단백질이 카스파제에 의해 분해 또는 절단되는지 여부를 결정 및 확인하고 카스파아제 절단 부위를 확인하는 데 도움이 됩니다. 이 방법은 기본적인 분자 및 세포 생물학 실험실 설정과 연구 기술만 필요하며 전문 장비나 소프트웨어 교육이 필요하지 않습니다. 이 방법은 다른 동물 바이러스 또는 미생물에 의한 감염 및 독소 및 화학 물질과 같은 외부 자극에 대한 노출과 관련된 유사한 목표를 달성하도록 조정할 수 있습니다.
시작하려면 12웰 세포 배양 플레이트에 MDCK 또는 A549 세포를 시드합니다. 세포를 5%이산화탄소 분위기 하에서 섭씨 37도에서 밤새 배양합니다. 다음날, 세포에서 오래된 배양 배지를 제거하고 1 밀리리터의 무혈청 MEM으로 각 웰의 세포를 두 번 세척하십시오.
이어서, 400 마이크로리터의 인플루엔자 A 바이러스 접종물을 첨가하여 세포를 감염시키고, 플레이트를 1시간 동안 배양하도록 놓았다. 배양 후, 바이러스 접종물을 제거하고 MEM으로 세포를 세척한다. 각 웰에 1밀리리터의 무혈청 MEM을 추가하고 이전 단계와 같이 세포를 배양합니다.
24 시간 후, 1 밀리리터 주사기 플런저로 세포를 긁어 내고 1.5 밀리리터 튜브로 옮깁니다. 튜브를 실온에서 2분 동안 12, 000G에서 원심분리하고 상층액을 수집한다. 세포 펠릿을 250마이크로리터의 인산염 완충 식염수와 원심분리기로 세척합니다.
상청액을 제거하고 100 마이크로리터의 세포 용해 완충액을 첨가한다. 소용돌이에 의해 혼합. 튜브를 섭씨 98도에서 10 분 동안 가열하여 세포를 완전히 용해시킵니다.
그런 다음 표준 SDS 폴리아크릴아미드 겔 전기영동으로 감염되지 않은 샘플과 감염된 샘플에서 동일한 양의 단백질을 분해합니다. 전기 영동 후 단백질 겔을 니트로셀룰로오스 또는 PVDF 막으로 옮기고 웨스턴 블로팅을 수행합니다. 모의 처리 및 억제제 처리 감염된 샘플 레인의 단백질 수준을 비교합니다.
Opti-MEM과 같은 100마이크로리터의 적절한 배지에서 100나노몰의 대조군 또는 카스파아제 siRNA 또는 적절한 부피의 형질주입 시약을 희석합니다. 실온에서 5 분 동안 배양하십시오. 100 마이크로리터의 각 siRNA 용액을 100 마이크로리터의 형질주입 시약 용액과 혼합하고, 실온에서 20 내지 45분 동안 배양한다.
100, 000 MDCK 또는 A549 세포를 800 마이크로 리터의 완전한 성장 배지에 분할하고 첨가하십시오. 200 마이크로리터의 siRNA 형질주입 시약 복합체를 첨가하고 이 현탁액을 12-웰 배양 플레이트에 첨가한다. 세포를 섭씨 37도에서 5% 이산화탄소 분위기에서 72시간 동안 배양합니다.
인플루엔자 A 바이러스로 세포를 감염시키되 억제제는 사용하지 마십시오. 웨스턴 블로팅을 수행하고, 이전에 나타낸 바와 같이 단백질 수준을 비교한다. 카스파아제 절단 모티프 XXXD 및 DXXD를 폴리펩티드 상에 위치시킨다.
P1 아스파르트산, 2개의 글루탐산 또는 알라닌을 부위 지시 돌연변이유발에 의해 돌연변이시키고 DNA 시퀀싱으로 확인한다. 100 마이크로리터의 적절한 배지에서, 2 마이크로그램의 야생형 또는 돌연변이 혈장 DNA 또는 형질주입 시약의 권장 부피를 희석하고, 실온에서 5분 동안 튜브를 인큐베이션한다. 100 마이크로리터의 혈장 DNA 용액을 100 마이크로리터의 형질주입 시약 용액과 혼합하고, 실온에서 20 내지 45분 동안 인큐베이션한다.
그 동안 300, 000 MDCK 또는 A549 세포를 800 마이크로 리터의 완전한 성장 배지에 분할하고 첨가하십시오. 200마이크로리터의 DNA 형질주입 시약 복합체를 추가하고 이 현탁액을 12웰 배양 플레이트에 추가합니다. 플레이트를 5%이산화탄소 분위기 하에서 섭씨 37도에서 배양합니다.
48 시간 후, 억제제없이 인플루엔자 A 바이러스로 세포를 감염시킨다. 웨스턴 블로팅을 수행하고, 이전에 나타낸 바와 같이 단백질 수준을 비교한다. 웨스턴 블로팅을 사용하여, 인플루엔자-유도된 숙주 카스파제에 의한 숙주 코르탁틴의 분해를 평가하였다.
인플루엔자 바이러스에 감염된 세포를 카스파제-3 억제제로 처리하면 코르탁틴이 구출되고 바이러스 NP가 분해되었습니다. 코르 탁틴 밴드의 강도의 정량화와 해당 액틴 밴드와의 정상화는 caspase-3 억제제로 처리 된 감염된 세포에서 코르 탁틴의 수준이 처리되지 않은 감염된 세포에 비해 더 높다는 것을 보여 주었다. 카스파 제 -6 또는 카스파 제 -7 고갈 된 세포에서.
코르탁틴 폴리펩티드 수준에서의 유의한 회복은 관찰되지 않은 반면, 카스파제-3 고갈된 세포에서, 인플루엔자 바이러스로부터 회복된 코르탁틴은 분해를 유도하였다. 폴리펩티드 수준의 정량화 및 비교는 고갈된 카스파제-3 발현을 갖는 감염된 세포에서의 코르탁틴 폴리펩티드 수준이 정상 카스파제-3 발현을 갖는 세포보다 더 높다는 것을 보여주었다. 위치 116에서 글루탐산에 대한 아스파르트산의 돌연변이는 인플루엔자 바이러스에 내성을 가진 코르탁틴 폴리펩티드를 유도된 분해로 만들었다.
폴리펩티드 수준의 정량화 및 비교는 감염된 세포에서 돌연변이 코르탁틴 폴리펩티드의 수준이 야생형 코르탁틴 폴리펩티드의 수준보다 높다는 것을 보여주었다. 수십 개의 돌연변이체를 생성하고 폴리펩티드에서 카스파아제 절단 부위를 확인하기 위해 반복적인 웨스턴 블롯팅을 수행하는 것이 요구된다. 정제된 카스파아제 및 표적 폴리펩티드를 함유하는 시험관내 생화학적 분석은 관심 단백질이 직접 가스 기반 기질임을 확인하기 위해 개발될 수 있다.
이 프로토콜은 바이러스 감염 또는 질병과 같이 연구되고 있는 시스템에서 표적 단백질의 중요성, 분해 또는 절단을 이해하는 데 도움이 될 것이다.
